2. 新疆医科大学基础医学院机能中心, 新疆 乌鲁木齐 830011
2. Center of Medical Function Experiment, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
高血压是一种渐进的慢性疾病,大量纵向随访资料证实,高血压可引起心、脑、肾和血管的病变,进一步导致脑卒中、充血性心力衰竭、慢性肾功能衰竭、主动脉夹层等严重并发症[1]。长期血压增高可致心脏负荷增加,引起心肌肥厚,其早期呈代偿性变化,中期出现功能性变化,晚期可出现器官衰竭甚至危及生命。心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是心脏对慢性压力和(或)容量负荷的反应,同时也是心血管疾病非常重要的独立危险因素之一。
榅桲(Cydonia Oblanga Miller.),英文名称Quince,是蔷薇科(Rosaceae)榅桲属(Cydonia)的灌木植物,榅桲别名木梨。榅桲属仅榅桲一种,是古老珍奇稀少的果树之一[2]。据有关古代埃及文物考证及历史记载,榅桲已有4 000多年以上的栽培历史[3]。榅桲原产于伊朗和土耳其,目前在世界各国皆有分布。在我国广泛分布于新疆南部及陕西、东北等地区,且产量较大。新疆维吾尔族人称榅桲为“比也”,维吾尔族人除生食榅桲外,主要用作抓饭的辅助品,熬制果酱等。榅桲也是疗效独特、具有浓郁的地方民族色彩的传统维药,果、叶、根、枝等部分均可入药,富含具有药用价值的化学成分,如鞣质类、有机酸、氨基酸、挥发油和黄酮等[4]。榅桲叶含酮糖3.05%、鞣质5.56%、黏质7.72%、脂质4.83%,还含有氰苷[5]。据《维吾尔常用药材学》等文献记载,榅桲除了具有降血压、调血脂等作用外,还有补血、补肾、止咳、止泻、利尿、治疗月经不调、防治心脏病等功效。国外文献报道,榅桲提取物具有抗氧化、抗炎、抗过敏、免疫抑制、抗肿瘤等作用[6, 7, 8, 9, 10]。
本课题组前期研究结果显示,榅桲乙醇粗提取物可明显降低肾性高血压大鼠血压,通过不同溶剂萃取部位的药效学筛选,确认榅桲叶抗高血压有效部位为乙酸乙酯部位,进一步进行化学成分分离鉴定,推测榅桲发挥抗高血压作用的主要化学成分可能为黄酮类化合物[11, 12, 13, 14]。本研究观察了榅桲总黄酮对自发性高血压大鼠心肌肥厚的影响,进一步从抑制循环和局部组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性的角度探讨其可能的作用机制,为榅桲的开发利用提供实验基础及理论依据。
1 材料 1.1 原材料及药品榅桲叶总黄酮;卡托普利片(captopril,CAP),规格:25 mg/片,国药准字H19993357,批号20130530,山西津华晖星制药有限公司;杜仲平压片(Eucommia ulmoides Oliver,EUO),规格:0.3 g/片,国药准字Z20025296,批号:20130915,西安正大制药有限公司。
1.2 试剂与仪器 1.2.1 主要试剂碘[125I]血管紧张素Ⅱ(125I-AngiotensinⅡ,125I-AngⅡ)放射免疫试剂盒:北京北方生物技术研究所,批号:130510;碘[125I]醛固酮(125Ⅰ-Aldosterone,125I-ALD)放射免疫试剂盒:北京北方生物技术研究所,批号:130510;TRIzol:Invitrogen,批号:15596018;Agarose:Sangon Biotech,批号:AB0013-250 g;6×Loading buffer:TaKaRa,批号:9156;Ethidium Bromide:Sigma,批号:E8751;异丙醇:天津市富宇精细化工有限公司;qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统:Invitrogen,批号:C28025-032;SYBR Select Master Mix:ABI,批号:4472920;BCA Protein Assay Kit:Beijing Tiangen,批号:PA115-02;RIPA裂解液:康维,批号:CW2333;组织蛋白抽提试剂:康维,批号:CW0004A;蛋白磷酸酶抑制剂:康维,批号:CW2383;蛋白酶抑制剂:康维,批号:CW2200;Pierce Goat Anti-Mouse IgG,(H+L),Peroxidase Conjugated:Thermo Scientific,NO:31430;Pierce Goat Anti-Rabbit IgG,(H+L),Peroxidase Conjugated:Thermo Scientific,NO:31460;蛋白预染Marker:Thermo Scientific,NO:26634;β-巯基乙醇:Amresco,NO:0482-100mL;Tris:Amresco,NO:0497-500g;SDS:Amresco,NO:0227-100g;丙烯酰胺:Amresco,NO:0341-500g;N,N’-亚甲双丙烯酰胺:Amresco,NO:0172-100g;PVDF Transfer Membrane(0.45 μm):Millipore,NO:IPVH00010;Glycine:Sangon Biotech,NO:G0167-500g;glycerine:Sangon Biotech,NO:G0854-100mL;Tween 20:Sangon Biotech,NO:T0777-500mL;SuperSignal West Prico Chemiluminescent Substrate:Thermo Scientific,NO:34080;β-actin(Mouse):Abcam,NO:ab8226;Anti-Angiotensin Converting Enzyme 2 抗体(Rabbit):Abcam,NO:ab108252;Anti-Angiotensin Converting Enzyme 1 抗体(Mouse):Abcam,NO:ab11734;Anti-Angiotensin II Type 1 Receptor 抗体(Rabbit):Abcam,NO:ab18801。
1.2.2 主要仪器设备台式高速冷冻离心机Neofuge 15R(上海力申科学仪器制造厂);核酸蛋白定量仪K5500(北京凯奥);水平电泳仪DYCP-31DN(北京六一仪器厂);凝胶成像系统(UVP,USA);MyCycler Thermal Cycler梯度PCR仪(Bio-Rad,USA);Real Time PCR instrument 7500(ABI,USA);xMarkTM酶标仪(Bio-Rad,China);化学发光成像仪系统Chemiscope 3000(上海勤翔科学仪器有限公司);蛋白转膜仪Mini-PROTEAN Tetra system(Bio-Rad,USA);电泳仪DYCZ-24DN(北京六一仪器厂);电子天平CP324S(Sartorius,Germany);脱色摇床TS-3D(江苏其林贝尔)。
1.3 动物SHR大鼠48只,WKY大鼠8只,♂,13周龄,体质量260~280g,SPF级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2007-0001。所有动物均饲养于新疆医科大学动物实验中心SPF级屏障系统内,4只/笼,恒温(22±2)℃,恒湿(55±5)%,每天人工光照明暗各12 h,24 h自由取食和饮水。动物实验由新疆医科大学第一附属医院实验动物科学部审核,符合动物伦理委员会的管理准则。
2 方法 2.1 榅桲总黄酮的制备方法榅桲叶用水洗净,55℃鼓风干燥48 h,冷却后粉碎过筛,采用索式提取器石油醚脱脂2 h,药渣挥干溶剂,真空干燥。干燥药渣以30倍量60%乙醇超声提取3次,每次40 min,合并滤液,减压浓缩至浸膏状,真空干燥得榅桲叶总黄酮粗品。总黄酮粗粉加水溶解,过滤,滤液先经AB-8型大孔吸附树脂分离,乙醇洗脱,收集洗脱液,减压蒸馏得浓缩液。浓缩液再经聚酰胺树脂分离,乙醇洗脱,收集洗脱液,减压蒸馏得浓缩液,冷冻干燥后即得榅桲叶总黄酮的精制品,测定粉末中总黄酮含量为65.36%,备用。
2.2 实验动物分组及给药WKY组:WKY大鼠8只,灌胃给予蒸馏水10 μL·g-1;SHR大鼠48只按体重随机分为如下6组,每组8只:模型组(SHR):灌胃给予蒸馏水10 μL·g-1;榅桲叶总黄酮低剂量组(SHR+COMF-L):灌胃给予榅桲叶总黄酮40 μg·g-1;榅桲叶总黄酮中剂量组(SHR+COMF-M):灌胃给予榅桲叶总黄酮80 μg·g-1;榅桲叶总黄酮高剂量组(SHR+COMF-H):灌胃给予榅桲叶总黄酮160 μg·g-1;卡托普利组(SHR+CAP):灌胃给予卡托普利25 μg·g-1;杜仲平压片组(SHR+EUO):灌胃给予杜仲平压片30 μg·g-1。卡托普利和杜仲平压片组给药剂量均按照人与大鼠体表面积法折算等效剂量。各组大鼠每日1次灌胃给药,灌胃周期均为16周,灌胃容积为10 μL·g-1。每周测定体重1次,并调整给药剂量。
2.3 标本采集与指标测定 2.3.1 血浆的制备末次给药后,用浓度为20 mg·g-1戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠(30 μg·g-1),立即腹主动脉取血2 mL至采血管内(含20 μL EDTA-Na2、20 μL 8-羟基喹啉、10 μL抑肽酶),冰水浴冷却,1 000 r·min-1 4℃离心5 min;取血2 mL至采血管内(含0.1 g·L-1肝素抗凝),3 000 r·min-1离心15 min。用微量移液枪分别吸取上清液,分装至1.5 mL的EP管中,置-80℃超低温冰箱内冻存待测。
2.3.2 左室肥厚指数测定取血后,立即开胸腔取出心脏,用生理盐水冲净血液,以滤纸吸干水分后称重,计算脏器指数(脏器重/体重×100%)。心脏沿室间隔剪开,并分离出左、右心室,以滤纸吸干水分后分别称重,计算心脏重量和体重比(HW/BW)、左室重量和体重比(LVM/BW),观察靶器官损伤,评价左室肥厚程度。
2.3.3 组织病理学检查称重完毕后,取部分组织固定于100 mg·g-1中性福尔马林溶液,石蜡包埋,4~6 μm厚度切片,HE染色,观察心脏的组织病理学改变。在400倍光镜下,于心肌横断面选取细胞核位于中央的心肌细胞,细胞横径为经核至细胞短轴边缘。通过HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析软件,测量左心室心肌细胞横径为心肌细胞直径(cardiacmyocyte-diameter,CD)及心肌细胞横截面积(cross-sectional area of cardiac myocyte,CSA)。每张切片随机选取3个视野(400倍),每次计数20个细胞,取平均值。
2.3.4 组织匀浆液的制备取部分心脏组织,在冰冷的生理盐水中反复漂洗除去残血,滤纸拭干,称重,按1 ∶9的比例加入0.86%冷生理盐水作为匀浆介质,用眼科剪尽快剪碎组织块,倒入玻璃匀浆管中,用内切式组织匀浆机匀浆,匀浆时间10 s/次,间隙30 s,匀浆3~5次(所有操作均在冰水浴中进行),然后置4℃低温离心机内,3 000 r·min-1离心15 min,立刻吸取上清液分装至1.5 mL EP管,-80℃超低温冰箱内冻存待测。
2.3.5 AngⅡ和ALD含量测定用放免法测定血浆或组织匀浆液中AngⅡ和ALD的含量,测定方法按试剂盒说明书进行。
2.3.6 ACE、ACE2、AT1 mRNA的相对表达量的测定总RNA的提取采用TRIzol法,应用核酸蛋白定量仪测定总RNA的浓度,RNA样本A260/A280的比值范围在1.8~2.2之间。参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录,合成cDNA,用cDNA模板对大鼠内参照β-actin、ACE、ACE2 及AT1的基因分别进行PCR扩增,用Primer 5.0 软件辅助设计引物。内参照β-actin引物序列为:上游引物:5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,下游引物:5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,扩增产物长度150 bp;ACE引物序列为:上游引物:5′- ATTGCAGCCGGGCAACTT-3′,下游引物:5′- CTCCGTGATGTTGGTGTCGT-3′,产物长度133 bp;ACE2引物序列为:上游引物:5′- GAATTCGACTGTGGGGTGGA-3′,下游引物:5′- TCTGCCTCCCCAAAAGGAAC-3′,产物长度207 bp;AT1引物序列为:上游引物:5′-CTCTGCCACATTCCCTGAGTT-3′,下游引物:5′- CTTGGGGCAGTCATCTTGGA-3′,产物长度212 bp。扩增反应体系为20 μL,其中cDNA 1 μL;上下游引物各0.4 μL; SYBRR Select Master Mix(2×)10 μL; RNase-free water补足至20 μL。扩增参数为:预变性95℃ 2 min,95℃变性15 s,退火60℃ 30 s,60℃延伸30 s,共40个循环。用2-ΔΔCt法来测定基因表达水平的变化:荧光定量PCR分析仪测得目的基因和参比基因的Ct值(Ct值为每一个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数),将Ct值转化为相对倍数,基因相对表达量用实验组/对照组=2-ΔΔCt表示。ΔΔCt=(Ct目的-Ct参比)实验-(Ct目的-Ct参比)对照。
2.3.7 Western blot 法检测SHR大鼠心肌组织ACE、ACE2、AT1蛋白表达大鼠心肌组织样本经液氮研磨后取100 mg,加入500 μL RIPA裂解液(已加入蛋白酶抑制剂),充分混匀。冰上放置30 min后匀浆器匀浆,冰上放置20 min,12 000 r·min-1,4℃,离心15 min,收集上清,BCA法测定蛋白浓度。样本中加入适量5×SDS-PAGE loading buffer,100℃沸水加热处理5 min,使蛋白充分变性,12 000 r·min-1离心5 min,取上清备用。预染蛋白marker 10 μL,样品每孔上样组织蛋白60 μg。80V恒压使溴酚蓝至分离胶处,恒压100V,90 min,溴酚蓝到达较底部时,停止电泳。采用恒压转膜,电压100 V,β-actin、AT1转膜60min,ACE、ACE2转膜90min。染色、封闭后一抗(β-actin、ACE、ACE2、AT1) 4℃孵育24 h,二抗(Pierce Goat Anti-Mouse IgG,Pierce Goat Anti-Rabbit IgG)室温孵育1 h。加显色液,用ChemiScopemini化学发光仪检测、拍照,计算目的蛋白的积分光密度值,并与β-actin比较,计算目的蛋白的表达丰度。
2.4 统计学分析计量资料以 ± s表示,统计分析采用SPSS 17.0软件One-Way ANOVA方法进行多组样本均数的比较,两组间比较采用LSD检验。
3 结果 3.1 左室肥厚指数与WKY组比较,SHR组大鼠HW、HW/BW、LVM、LVM/BW均有明显增加(P < 0.01);与SHR组相比,SHR+COMF-M和SHR+COMF-H组HW、HW/BW、LVM、LVM/BW均有不同程度减小(P < 0.01或P < 0.05),SHR+COMF-H组变化更为明显(P < 0.01)。结果见Tab1。
( ± s, n=8) | |||||
Group | BW/g | HW/mg | HW/BW/mg·g -1 | LVM/mg | LVM/BW/mg·g -1 |
WKY | 383±13 | 1047±88 | 2.73±0.19 | 812±76 | 2.12±0.18 |
SHR | 341±13 ## | 1144±81 # | 3.36±0.21 ## | 988±84 ## | 2.90±0.21 ## |
SHR+CAP | 334±9 | 985±71 ** | 2.95±0.21 ** | 831±79 ** | 2.49±0.21 ** |
SHR+EUO | 339±13 | 1058±76 * | 3.12±0.24 * | 893±61 * | 2.64±0.23 * |
SHR+COMF-L | 337±10 | 1152±75 | 3.41±0.17 | 997±80 | 2.95±0.17 |
SHR+COMF-M | 336±12 | 1036±81 * | 3.08±0.15 * | 901±67 * | 2.68±0.14 * |
SHR+COMF-H | 339±10 | 991±67 ** | 2.92±0.13 ** | 819±70 ** | 2.41±0.14 ** |
#P < 0.05,##P < 0.01 vs WKY group;*P < 0.05,**P < 0.01 vs SHR group |
HE染色显示,从心肌纵切面来看,WKY组心肌细胞肌纤维排列整齐、胞核明显,无细胞肿胀;与WKY组相比,SHR心肌细胞肥大,间质增宽,细胞核增多且排列不规则,心肌纤维断裂融合,心肌纤维增粗,直径变大,部分心肌细胞核肥大或固缩。各药物治疗组心肌病变有不同程度好转,局部心肌排列紊乱,心肌细胞肥大程度较SHR组为轻。结果见Fig1。
从心肌横切面测量结果来看,与WKY组大鼠相比,SHR左心室心肌细胞直径增加了50.9%,心肌细胞横截面积(CSA)增大了104.6%(P < 0.01);与SHR组相比,SHR+COMF-H组心肌细胞直径减小了4.6%(P < 0.05),心肌细胞横截面积减小了13.6%(P < 0.05)。结果见Tab2。
( ± s, n=8) | ||||
Group | CD/μm | CAS/μm2 | ||
WKY | 16.3 | ±1.5 | 505 | ±45 |
SHR | 24.6 | ±3.1## | 1033 | ±92## |
SHR+CAP | 20.7 | ±2.8** | 816 | ±77** |
SHR+EUO | 25.2 | ±2.2 | 1044 | ±86 |
SHR+COMF-L | 24.3 | ±2.7 | 992 | ±101 |
SHR+COMF-M | 23.9 | ±2 | 925 | ±85 |
SHR+COMF-H | 21.8 | ±1.8* | 892 | ±83* |
##P < 0.01 vs WKY group;*P < 0.05,**P < 0.01 vs SHR group |
从实验结果可以看出,与WKY组相比,SHR组心脏和血液中AngⅡ、ALD含量均有明显升高(P < 0.01)。与SHR组相比,各给药组AngⅡ、ALD含量均有不同程度减少,其中SHR+CAP组、SHR+COMF-M组和SHR+COMF-H组变化差异有统计学意义(P < 0.01或P < 0.05)。结果见Tab3。
( ± s,n=8) | ||||
Group | AngⅡ | ALD | ||
Heart/μg·L-1 | Blood/μg·L-1 | Heart/μg·L-1 | Blood/μg·L-1 | |
WKY | 5.22±0.51 | 0.34±0.04 | 0.08±0.011 | 0.17±0.02 |
SHR | 7.65±0.76## | 0.53±0.06## | 0.13±0.012## | 0.26±0.02## |
SHR+CAP | 6.54±0.71** | 0.45±0.06** | 0.09±0.015** | 0.19±0.02** |
SHR+EUO | 7.67±0.54 | 0.49±0.05 | 0.12±0.012 | 0.25±0.03 |
SHR+COMF-L | 7.39±0.62 | 0.48±0.06 | 0.11±0.017* | 0.24±0.02 |
SHR+COMF-M | 7.17±0.83* | 0.45±0.04** | 0.12±0.014 | 0.23±0.02* |
SHR+COMF-H | 7.25±0.65* | 0.46±0.06* | 0.11±0.015* | 0.21±0.02** |
##P < 0.01 vs WKY group;*P < 0.05,**P < 0.01 vs SHR group |
与WKY组相比较,SHR组心肌组织ACE和AT1的mRNA相对表达量明显增加,ACE2的mRNA相对表达量明显降低(P < 0.01);与SHR组相比较,各给药组心肌组织ACE和AT1的mRNA相对表达量有不同程度减少,ACE2的mRNA相对表达量有不同程度增加(P < 0.01或P < 0.05)。结果见Tab4。
( ± s,n=8) | |||
Group | ACE /β-actin | ACE2/β-actin | AT1 /β-actin |
WKY | 1.01±0.16 | 1.02±0.08 | 1.01±0.15 |
SHR | 2.72±0.38## | 0.40±0.09## | 2.72±0.35## |
SHR+CAP | 1.24±0.17** | 0.79±0.05** | 1.17±0.34** |
SHR+EUO | 1.35±0.16** | 0.75±0.08** | 1.62±0.24** |
SHR+COMF-L | 1.68±0.15** | 0.67±0.13* | 1.57±0.25** |
SHR+COMF-M | 1.18±0.12** | 0.70±0.13** | 1.48±0.28** |
SHR+COMF-H | 1.36±0.24** | 0.88±0.04** | 1.23±0.29** |
##P < 0.01 vs WKY group;*P < 0.05,**P < 0.01 vs SHR group |
与WKY组相比较,SHR组心肌组织ACE和AT1的蛋白表达明显增加,ACE2的蛋白表达明显降低(P < 0.01);与SHR组相比较,各给药组心肌组织ACE和AT1的蛋白表达均有不同程度减少,ACE2的蛋白表达有不同程度增加(P < 0.01或P < 0.05)。结果见Fig2。
4 讨论心室重构是高血压左室心肌病变的重要表现,是指由于心肌损伤、压力或容量的超负荷所导致的心室质量、心腔大小和容积的变化,在细胞水平则表现为心肌细胞肥大、凋亡、成纤维细胞增生、单核炎症细胞的异常浸润,是心脏收缩功能障碍及心律失常等病理变化的基础,也是高血压病的主要病理改变。心肌肥大的早期因心室壁增厚,心肌收缩功能改善而被认为是代偿性的过程。然而,持续病理性应激的情况下,心肌肥大伴随着纤维化,收缩舒张功能的异常改变,发生了失代偿,由心肌肥大发展到心衰,由心衰而死亡是临床病人的主要死因之一。在病理条件下,RAAS是引起高血压形成的首要因素。AngⅡ是RAAS中最主要的生物活性肽,与AT1受体结合,促使血管平滑肌发生剧烈收缩,使动脉压升高和外周阻力增加,是高血压形成的重要原因之一;促进醛固酮的分泌,水钠潴留,血压升高;刺激血管平滑肌细胞和心肌细胞的增殖肥大,增加血管对缩血管物质的反应性[15, 16]。局部组织中也可以产生和分泌肾素-血管紧张素,并以自分泌和旁分泌的形式影响心血管系统功能[17],如刺激血管平滑肌增殖,使管壁增厚;提高AngⅡ受体亲和力,促进AngⅡ与受体结合;介导心肌重构、心肌肥大和纤维化。ACE2可水解AngⅡ产生具有扩血管作用的Ang-(1-7),与AngⅡ相拮抗[18]。
榅桲是新疆南部地区开发利用价值很高的稀有果树,也是我国北方干旱地区开发利用的稀有果树之一。新疆榅桲占全疆果树总数第11位,主要分布在天山以南沿塔里木盆地边缘的绿洲上,以阿克苏地区的沙雅、新和、库车最多[19]。本研究结果显示,榅桲总黄酮可降低SHR心脏指数和左室肥厚指数,组织病理学研究显示,榅桲总黄酮可减轻SHR心肌细胞肥大程度,表明其有抑制高血压大鼠心肌肥厚的发生发展的作用。实验结果进一步显示,榅桲总黄酮不仅可降低血浆中AngⅡ和ALD的含量,同时也降低心肌组织中AngⅡ和ALD的含量,表明榅桲总黄酮可抑制循环和心脏局部RAAS活性。RT-PCR和Western blot结果显示,榅桲总黄酮可减少ACE、AT1的mRNA和蛋白的相对表达量,同时增加ACE2 mRNA和蛋白的相对表达量,表明榅桲总黄酮可能在基因转录和翻译水平上发挥作用,从而抑制RAAS活性。推测榅桲总黄酮可通过抑制ACE而使AngⅡ合成减少,并通过降低AT1的表达,减少与AngⅡ结合的水平。同时,榅桲总黄酮增加了ACE2 mRNA相对表达量和蛋白表达水平,从而增加了Ang-(1-7)的水平,Ang-(1-7)与MAS受体结合后,拮抗了AngⅡ的缩血管、促进心肌细胞肥大和心室重构的作用。本课题将进一步对榅桲的有效成分进行分离鉴定,并探讨其作用机制,为榅桲的开发利用提供实验基础及理论依据。
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