2. 暨南大学医学院生理学系, 广东 广州 510632
王立伟(1959-),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:细胞生理学,通讯作者,Tel:020-85226565,E-mail:wangliweic@sohu.com
2. Dept of Physiology, Medical College, Jinan University, Guangzhou 510632, China
钩吻(gelsemium),又名大茶药、断肠草等,是马钱科植物葫蔓藤的根、叶及全草,全株有剧毒。长期以来,钩吻用于治疗湿疹、皮廯、创伤性损伤、骨折、炎症、溃疡、慢性疼痛、焦虑等疾病[1]。近年来,人们开始关注钩吻的抗肿瘤作用。研究显示,钩吻总碱(gelsemium alkaloids)可抑制肝癌HepG2细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞等细胞增殖,时间依赖性和浓度依赖性诱导细胞凋亡[2, 3, 4]。
氯通道是人体各种细胞广泛分布的阴离子通道,参与细胞包括增殖、迁移等多种生理功能的调节,具有广泛而重要的生理意义。我们实验室的前期研究发现,氯通道参与多种抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的过程,激活容积敏感性氯通道产生凋亡性容积缩小(apoptotic volume decrease,AVD)以启动细胞凋亡[5, 6, 7]。同时,研究发现,多种生物碱如长春新碱、小檗碱等均具有高效低毒的抗肿瘤作用[8, 9]。钩吻总碱是提取于马钱科植物的一类吲哚生物碱,文献报道,其可浓度依赖性和时间依赖性诱导肝癌HepG2细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。然而,系统性的文献回顾,并未发现对钩吻总碱抗肿瘤作用离子机制的研究。本实验拟使用膜片钳技术研究钩吻总碱能否激活氯通道,进而探讨钩吻总碱的抗肿瘤作用是否与氯通道有关。
1 材料与方法 1.1 细胞培养人肝癌细胞(HepG2)培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养基,培养基加入双抗(10万IU·L-1青霉素、0.1 g·L-1链霉素),常规培养于37 ℃,饱和湿度,含体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中,隔天传代1次。实验时使用0.25% 胰酶常规消化并重悬细胞,将细胞悬液收集于4 mL EP管中,每次取200 μL接种于直径为22 mm的圆形玻片,于室温下静置30 min,待细胞贴壁后进行实验。
1.2 药物与试剂钩吻总碱由暨南大学药学院提供,溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulpoxide,DMSO)配制成浓度为10 mmol·L-1的储存液,实验时用等渗灌流液稀释成终浓度为2 μmol·L-1的工作液。Tamoxifen 购于Sigma公司,溶解于DMSO中,配制成浓度为20 mmol·L-1的储存液,实验时用相应的细胞外灌流液稀释成终浓度为20 μmol·L-1的工作液;NPPB购于Sigma公司,使用甲醇配制成100 mmol·L-1储存液,实验时稀释至100 μmol·L-1工作液。
1.3 细胞容积测量将附有贴壁细胞的玻片放入特制灌流浴槽中,于倒置显微镜下寻找合适的视野,设置拍摄程序,通过Image Pro Plus软件控制数字式摄像机动态拍摄,拍摄的图片使用ScIon Image 图像分析软件进行处理。通过测量细胞面积,进行面积与体积的转换,转换公式为:V=4/3×π×(S / π)3/2。实验分为3组:对照组灌流1 h等渗液;加药组在灌流5 min等渗液后,在等渗液中加入2 μmol·L-1钩吻总碱,继续记录55 min;阻断剂组在灌流5 min等渗液后,在等渗液中加入20 μmol·L-1 tamoxifen预处理5 min后,再加入钩吻总碱与tamoxifen混合液继续记录50 min。对细胞体积进行标准化处理:Vst=(Vb÷Vi)×100%;Vb为钩吻总碱处理后的细胞体积,Vi为等渗情况下的细胞体积。运用公式计算出细胞容积缩小率:ΔV%=[(Vi-Vmin)÷Vi]×100%,Vmin为钩吻总碱处理后细胞的最小体积。
1.4 膜片钳实验 1.4.1 细胞外灌流液等渗灌流液(isotonic solution)渗透压为300 mOsmol·L-1,含(mmol·L-1):70 NaCl,2 CaCl2,0.5 MgCl2,10 HEPES,140 D-mannitol;高渗液(47% hyper)渗透压为440 mOsmol·L-1,配方为等渗液中加入140 mmol·L-1的D-mannitol。使用Osmomat 030冰点渗透压计(Osmomat 030;Gonotec,Germany)测定配制溶液的渗透压,用Tris 碱调pH值至7.4。
1.4.2 电极内液电极内液含(mmol·L-1):70 N-methyl-D-glucamine chloride(NMDG-Cl),1 EGTA,1.2 MgCl2,10 HEPES,140 D-mannitol,2 ATP,用Tris 碱调pH值为7.20。
1.4.3 全细胞膜片钳记录取指数生长期的HepG2细胞,用0.25%胰酶消化重悬,将细胞悬液收集于4 mL EP管中,使用移液器每次取200 μL接种于直径为22 mm的圆形玻片上,室温下静置30 min,待细胞贴壁后,将玻片黏附于特制浴槽并置于倒置显微镜进行实验。膜片钳参数设置及记录方法见参考文献[10]。
将贴有细胞的圆形玻片置于特制灌流系统中,采用全细胞记录模式记录HepG2细胞膜电流。在灌流等渗液时,记录下2~4 min的稳定背景电流,随后加入2 μmol·L-1钩吻总碱灌流细胞,保持灌流液面的平稳,观察并记录激活电流的潜伏期、电流密度等参量。待激活电流达峰并平稳后,分别加入47%高渗液、tamoxifen、NPPB,观察高渗液和氯通道阻断剂对钩吻总碱激活电流的影响,分别计算电流抑制率。抑制率计算公式:抑制率/%= [(C max-CIso)-(CBlockers-CIso)]/(Cmax-CIso)×100%,其中CIso为灌流等渗液时基础电流,Cmax为加入总碱后激活的最大电流,CBlockers为加入阻断剂后的最大电流。
1.5 统计学处理实验所得数据采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析,数据用 ± s表示,根据实验情况的不同,选择配对t检验或独立样本t检验进行显著性检验,每项实验至少重复3次。
2 结果 2.1 钩吻总碱诱导HepG2 细胞产生AVD将贴壁的细胞玻片置于特制的灌流浴槽中持续细胞外灌流2 μmol·L-1钩吻总碱溶液,在倒置相差显微镜下选择合适的视野,通过拍图软件连续拍摄细胞图像,观察钩吻总碱对细胞容积的影响。如Fig1A、C所示,细胞外灌流等渗液时HepG2细胞体积比较稳定,在观察的60 min内细胞体积无明显变化(n=15,P>0.05)。当细胞外灌流2 μmol·L-1钩吻总碱溶液时,可见细胞容积明显缩小,出现AVD现象(Fig1B、D)。在细胞外灌流钩吻总碱溶液50 min后,细胞容积减小(12.48±2.2)%(n=15,P < 0.01)。
2.2 钩吻总碱诱导HepG2细胞产生的AVD可被氯通道阻断剂tamoxifen明显抑制为了探讨AVD的出现是否与氯离子通道有关,本实验在细胞外预先灌流氯通道阻断剂tamoxifen后,继而灌流同等浓度的tamoxifen和钩吻总碱混合液。如Fig2所示,细胞外灌流tamoxifen 5 min后,细胞体积增大3.28%(n=15,P>0.05),继而灌流tamoxifen与钩吻总碱混合液后,细胞体积相比于tamoxifen灌流后的最大体积减小5.06%(n=15,P>0.05),相比于等渗液仅减小0.79%(n=15,P>0.05)。与单纯灌流钩吻总碱(细胞体积减小12.48%)相比,细胞体积缩小被明显抑制(n=15,P < 0.01),这提示钩吻总碱引起HepG2 细胞产生AVD可能与氯通道有关。
2.3 钩吻总碱可以激活HepG2细胞电流钩吻总碱引起HepG2细胞产生AVD与氯通道有关,而AVD又是多种抗肿瘤药物诱导癌细胞凋亡的特征性事件。为了进一步探讨钩吻总碱是否可以开放氯通道,通过细胞内水外流最终引起细胞体积缩小,我们采用全细胞膜片钳技术记录细胞外灌流钩吻总碱后,HepG2 细胞膜电流的变化。如Fig3A所示,钩吻总碱可以激活肝癌HepG2 细胞电流。Fig3B所示,当细胞外灌流等渗液时,细胞基础电流较小,在+80 mV电压钳制下,外向电流密度为(3.18±0.72)pA·pF-1,在-80 mV电压钳制模式下,内向电流密度为(3.30±0.79) pA·pF-1。当在等渗液中加入2 μmol·L-1钩吻总碱后,可以激活电流,其平均潜伏期为2.50 min(n=15)。在+80 mV电压钳制下,该激活电流外向电流密度为(33.20±2.85)pA·pF-1,内向电流密度为(21.94±3.03)pA·pF-1,呈明显的外向优势(Fig3B),无明显的时间和电压依赖性失活,该电流的翻转电位为(-3.21±0.67)mV,接近本实验条件下氯离子平衡电位理论值(-0.9 mV),这提示钩吻总碱激活的电流为氯电流。
2.4 钩吻总碱激活的电流可被氯通道阻断剂tamoxifen和NPPB阻断tamoxifen和NPPB是常用的氯通道阻断剂,为了证实钩吻总碱激活的膜电流为氯电流,我们观察了氯通道阻断剂tamoxifen和NPPB对该激活电流的作用。如Fig4A所示,细胞外灌流2 μmol·L-1钩吻总碱可以激活一具有明显外向优势的电流,当细胞外灌流20 μmol·L-1 tamoxifen后,可以完全抑制该电流。Fig4B所示,在+80 mV电压钳制下,tamoxifen可使外向电流由(32.82±2.48)pA·pF-1下降至(2.81±0.83)pA·pF-1(n=5,P < 0.01),抑制率为(111.07 ± 5.58)%;在-80 mV电压钳制下,内向电流由(22.13±4.71)pA·pF-1下降至(1.99±0.42)pA·pF-1(n=5,P < 0.01),抑制率为(106.09±2.25)%,tamoxifen对内、外向电流的抑制率差异没有统计学意义(n=5,P>0.05)。同样,NPPB对钩吻总碱激活的电流也有明显抑制(Fig4C、D)。100 μmol·L-1NPPB作用后,外向电流由(31.20±2.85)pA·pF-1下降至(4.64±0.39)pA·pF-1(n=5,P < 0.01)抑制率为(95.24±5.97)%,内向电流由(21.94±3.30)pA·pF-1下降至(3.34±0.32)pA·pF-1(n=5,P < 0.01),抑制率为(98.36±5.60)%,NPPB对内、外向电流的抑制差异亦无统计学意义(n=5,P>0.05)(Fig4C、D)。
2.5 钩吻总碱激活的氯电流具有容积敏感性上述实验证实了钩吻总碱引起HepG2细胞产生AVD的同时,可以激活HepG2细胞氯电流,这两种现象均可被氯通道阻断剂tamoxifen明显抑制。为了明确钩吻总碱激活的氯电流与细胞容积变化的关系,我们观察并记录了47 % 高渗溶液对钩吻总碱激活的氯电流的作用,以明晰氯通道在AVD中所起的作用。Fig5A 显示钩吻总碱激活的氯电流可被47% 高渗溶液明显抑制。如图所示,细胞外灌流2 μmol·L-1钩吻总碱可以激活一有外向优势的氯电流,当该电流达峰并稳定后,将钩吻总碱换为47% 高渗液后,可见外向电流由(29.94±3.59)pA·pF-1下降为(4.32±0.80)pA·pF-1,抑制率为(92.86±7.69)%,内向电流由(24.10±1.85)pA·pF-1下降至(2.92±0.24)pA·pF-1,抑制率为(93.96±5.78)%,内、外向电流抑制率差异无统计学意义(n=5,P>0.05)。Fig5B I/V曲线显示在加入钩吻总碱后,电流明显激活,激活的电流达峰稳定后,加入47%高渗液可明显抑制该电流(n=5,P < 0.01)。
3 讨论钩吻是马钱科植物葫蔓藤的全草,其全株有剧毒,以根、叶为主,钩吻总碱为其总生物碱提取物。在中国,钩吻长期用于治疗慢性疼痛、皮肤溃疡等疾病。
近年来,钩吻的抗肿瘤作用被广泛研究,研究表明钩吻可浓度依赖性和时间依赖性诱导多种肿瘤细胞凋亡。研究显示,多种钩吻碱单体如钩吻素子、钩吻碱甲及钩吻素己可明显抑制肝癌HepG2细胞增殖,其中钩吻素己对HepG2细胞有明显的时间和浓度依赖性抑制作用,而对正常的猴肾细胞无明显细胞毒性[2]。该研究发现,用钩吻碱处理48 h后的HepG2细胞出现明显形态学改变,细胞明显皱缩并且漂浮,同时细胞周期被阻滞于S期,细胞凋亡率明显增加,caspase-3、caspase-8和caspase-9活性呈浓度依赖性增加。而Zhang 等[11]在研究钩吻素子对人乳腺癌细胞(MCF-7)作用时发现,钩吻素子可明显诱导细胞凋亡,并阻滞细胞周期于G2/M期,同时发现,钩吻素子处理后的MCF-7细胞Bcl-2的表达下调,而 Bax 和caspase-3的表达上调。
我们实验室前期工作表明,氯通道作为人体最为广泛的阴离子,参与多种细胞生理活动调节,包括细胞凋亡[12]、细胞容积调节[13]、细胞迁移[14]等。研究显示,抗肿瘤药物可通过诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。紫杉醇可诱导人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)凋亡[6],顺铂可诱导人卵巢癌SKOV3/DDP细胞凋亡[15],这些研究发现,当细胞外灌流抗肿瘤药物时,细胞体积会缓慢减小,出现AVD,是细胞凋亡早期的特征性事件,离子流动在AVD中的作用已被普遍接受[16]。我们前期实验发现,在PC12细胞外灌流H2O2溶液时会引起细胞容积缩小,而氯通道阻断剂NPPB可以抑制H2O2引起的膜通透性增加和细胞皱缩,从而保护细胞免于凋亡[5],可见Cl-和水外流是AVD的主要机制之一。
本实验使用全细胞膜片钳技术直接观察钩吻总碱对人肝癌细胞(HepG2)氯电流的作用。实验结果表明,细胞外灌流含有钩吻总碱的等渗溶液可以激活一具有明显外向优势的电流,该电流无明显时间和电压依赖性失活,翻转电位为(-3.21±0.67)mV,接近于本实验条件下Cl-理论上的平衡电位(-0.9 mV),该电流可被氯通道阻断剂tamoxifen和NPPB阻断,故确定这一电流为氯电流。我们发现,tamoxifen对钩吻总碱激活的内、外向氯电流抑制率均超过100%,这是因为tamoxifen不仅抑制了钩吻总碱激活的氯电流,同时阻断了基础状态下开放的氯通道,即阻断了背景氯电流,故抑制率超过100%。另一方面,在tamoxifen抑制钩吻总碱诱导的AVD实验中,我们看到,加入tamoxifen预处理的HepG2细胞容积略微增加(n=15,P>0.05),这也说明tamoxifen可以阻断基础状态下开放的氯通道,使水外流减少,从而引起细胞体积相对增加。在细胞AVD实验中似乎提示钩吻总碱激活的氯通道与细胞容积存在关系,为了验证这一猜想,在钩吻总碱激活的电流达峰并稳定后加入47% 高渗溶液,我们发现,HepG2细胞明显皱缩,与此同时,钩吻总碱激活的氯电流几乎被完全抑制。我们前期工作发现,当细胞外灌流低渗溶液时,由于渗透压差,水分子跨细胞膜进入细胞引起细胞膨胀,细胞膨胀可激活容积敏感性氯通道,在电位差与浓度差的综合作用下,氯离子外流带走部分水,引起细胞体积缩小,即RVD(regulatory volume decrease)[17]。同理,当细胞外灌流高渗液后,由于细胞内外渗透压差,细胞失水皱缩,容积缩小,关闭了容积敏感性氯通道,这说明钩吻总碱激活的氯电流具有明显的容积敏感性。
综上所述,细胞外灌流钩吻总碱溶液可引起细胞容积减小,产生AVD现象,而氯通道阻断剂tamoxifen可以明显抑制这一现象。钩吻总碱激活的电流可被细胞外灌流47%高渗溶液抑制,显示出与低渗激活容积敏感性氯电流相似的特征[17],这说明该激活通道具有明显的容积敏感性,通过开放氯通道引起氯离子和水的外流,最终导致细胞容积缩小。而细胞容积缩小是细胞凋亡早期的特征性事件,这提示了钩吻总碱可能是通过诱导细胞凋亡性容积缩小过程而发挥抗肿瘤作用,而氯通道可能由于参与AVD的形成而作为钩吻总碱抗肿瘤作用的靶点之一。然而,容积敏感性氯通道是钩吻总碱抗肿瘤的直接靶点还是作为调节蛋白仍不清楚,有待进一步研究。
(致谢:本论文所涉及的所有实验均在暨南大学医学院501药理学实验室完成,在此对该实验室提供的实验帮助予以衷心的感谢。)
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