2. 福建省老年医学研究所, 福建 福州 350001
2. Fujian Institute of Geriatrics, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China
线粒体介导的氧化应激反应是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)重要的病理损害，因此减轻线粒体的氧化应激反应具有神经保护功效[1, 2]。虽然AD的发病机制目前仍然不是很清楚，但是Aβ的瀑布学说仍为大部分学者所接受。其中Aβ片段25-35 (Aβ25-35) 是Aβ毒性的核心片段[3, 4]。因此，运用毒性片段Aβ25-35来干预神经元可模拟AD样的病理生化改变[3]，这为AD的研究提供了可靠的细胞模型。
N-乙酰基半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)是常见的抗氧化剂。我们前期研究发现，Aβ25-35可增加Cdk5活性，从而增加tau蛋白的过度磷酸化[5]；而NAC可减轻Cdk5活性和tau蛋白磷酸化。所以，在我们实验室的前期研究基础上，本实验继续运用毒性片段Aβ25-35(20 μmol·L-1)来诱导原代培养皮质神经元损害，然后探讨NAC(10 mmol·L-1)对Cdk5上游信号calpain活性的影响。另外，线粒体功能受损可导致细胞内钙离子浓度升高[6]，进而激活calpain活性，所以我们测定与线粒体功能密切相关的指标，如H2O2、线粒体膜电位和ATP。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂Aβ片段25-35、NAC 均购自美国Sigma公司；胎牛血清购自中国杭州江滨生物技术有限公司；胰酶、DMEM-F12培养基、左旋多聚赖氨酸、10×Hanks平衡盐溶液、N2添加剂均购自美国Gibco公司。基础培养基：DMEM-F12、青霉素G(0.1 IU·L-1) 、NaHCO3(2 g·L-1)、HEPES (1.19 g·L-1)和链霉素(0.1 IU·L-1)。无血清培养基：基础培养基+N2添加剂。完全培养基：基础培养基 + N2添加剂(DMEM-F12 ∶N2= 1 ∶1)+10%胎牛血清。H2O2测定试剂盒购自美国Molecular Probes公司；N-succinyl-leu-tyr-7-amido-4-methylcoumarin购自美国Sigma公司；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)购自Cell Technology 公司；ATP测定试剂盒来自美国Roche公司。
1.1.2 仪器二氧化碳细胞培养箱(美国 Forma Scientific公司)；荧光酶标仪购自美国Bio-Tek公司；倒置显微镜(日本Olympus，CK40型)；化学发光检测仪(美国Berthold公司)。
1.1.3 动物SD孕鼠[孕(18±2) d]清洁级，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。
1.2 方法 1.2.1 胎鼠皮质神经元培养(详见参考文献[7])：孕鼠麻醉后取出胎鼠，然后剔除脑膜及分离皮质组织，再进行消化、分离皮质神经细胞，最后计数、接种培养板上。前3 d 使用完全培养基培养，然后换成无血清培养基，继续培养3 d，这样体外共培养6 d后进行相关实验研究。
1.2.2 凝聚态Aβ25-35的制备[8]用超纯水溶解Aβ25-35，配成1 mmol·L-1；然后储存于-20 ℃。在Aβ25-35使用前，将Aβ25-35融化并且置于37 ℃环境，总共孵育4 h。这样使得单体的Aβ25-35凝聚成凝聚态状态。
1.2.3 实验设计分组①空白对照组：未给予干预处理。②Aβ25-35组：20 μmol·L-1的Aβ25-35作用12 h。③ NAC预处理组：先给予10 mmol·L-1的NAC作用24 h，然后给予20 μmol·L-1 的Aβ25-35共同作用12 h。
1.2.4 荧光酶标仪测定calpain活性(详见参考文献[5])神经元经各种处理后，用calpain裂解液AS[20 mmol·L-1 Tris 缓冲液pH 7.4，140 mmol·L-1 氯化钠，0.1% Nonidet-40(乙基苯基聚乙二醇)和蛋白酶抑制剂Cocktail Set Ⅲ]裂解；收集裂解液后，在4 ℃下以10 000×g速度离心10 min；取上清液、进行蛋白定量；取20 μg 蛋白置于96 孔板中，同时加入calpain的作用底物130 μmol·L-1的N-succinyl-leu-tyr-7-amido-4-methylcoumarin，在30 ℃下避光孵育2 h。然后置于荧光酶标仪中(激发波 360 nm；发射波 480 nm)测定荧光数值。最后，把所得到的荧光值与空白对照组比较。
1.2.5 荧光酶标仪测定H2O2参考文献[1]和H2O2试剂说明书，用荧光方法测定细胞内产生的H2O2量。接种在96孔板的皮层神经元，经各种条件处理后，细胞暴露于含有50 μmol·L-1的Amplex Red reagent和0.1 kU·L-1辣根过氧化物酶(horseradish peroxydase，HRP)作用60 min，选择激发波540 nm和发射波590 nm，用多功能荧光酶标仪测定荧光强度。同时设置空白对照组。
1.2.6 线粒体膜电位测定使用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)来检测线粒体的膜电位。 根据试剂盒说明书及参考文献[1]，简要步骤如下：神经元经不同处理后，经胰酶消化后、洗涤。取相同数目的神经元，加入JC-1溶液，于37℃孵育15 min；然后洗涤多余的JC-1试剂，加入等体积的分析液，最后使用荧光酶标仪检测。所得的荧光强度比值反映线粒体内、外膜电位差：红色荧光强度(exλ550nm,emλ600nm)/ 绿色荧光强度(exλ485nm,emλ535nm)。
1.2.7 ATP水平测定参考文献[1]和ATP试剂盒说明书，用Roche 公司的ATP Bioluminescenee Assay Kit HSII检测细胞内ATP的含量。各组细胞用0.25％胰酶消化后收集，用ATP试剂盒中的溶解缓冲液(dilution buffer)将各组细胞数量调至107·L-1，之后加入ATP试剂盒中的细胞裂解试剂(cell lysis reagent)于15℃～25℃条件下作用5 min，最后加入等体积的荧光(素)酶试剂(luciferase reagent)，用化学发光检测仪检测化学发光的强度，比较不同组细胞内ATP水平。
1.2.8 统计学方法实验结果以图、数据表示。采用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析进行组间比较分析，所得的值以
± s (standard error of the mean) 表示。
胎鼠皮层神经元培养了6 d后，拟进行相关实验。如Fig1所示，光镜下培养了6 d的皮层神经元，神经元胞体立体感明显，突起广泛接触，形成神经网络。
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| Fig.1 Morphology of cortical neurons for 6 d under inverted microscope (×400) |
本实验用Aβ25-35作用皮层神经元12 h，然后测定神经元内calpain活性。结果如Fig2所示，与空白对照组相比较，神经元在Aβ25-35作用12 h后，calpain活性明显升高，这说明Aβ25-35可诱导神经元内calpain活性升高。为了研究NAC对神经元内calpain活性的影响，我们先给予10 mmol·L-1的NAC作用于皮层神经元24 h，然后与20 μmol·L-1的Aβ25-35共同作用12 h，最后测定神经元内calpain活性。结果显示，与Aβ25-35组相比较，NAC预先孵育组的神经元内calpain活性明显下降，且NAC预先孵育组的calpain活性与空白对照组中calpain活性水平接近。这提示了NAC可减轻Aβ25-35升高calpain活性的作用。
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Fig.2
NAC attenuated increase of calpain activity induced
by Aβ25-35( ± s , n=3)
Exposed to Aβ25-35 for 12 h, the calpain activity increased. Compared to the neurons treated with Aβ25-35 alone, the calpain activity decreased when the neurons were pre-incubated in NAC and co-treated with Aβ25-35. **P<0.01 vs Aβ25-35 group.
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H2O2是氧自由基的重要组成部分，我们运用荧光法测定细胞内的H2O2水平。如Fig3所示，与空白对照组相比较，20 μmol·L-1 的Aβ25-35作用12 h后，神经元的H2O2荧光值水平明显升高；10 mmol·L-1的NAC预先孵育24 h，再与20 μmol·L-1 Aβ25-35作用12 h，细胞内的H2O2明显下降。
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Fig.3
NAC decreased H2O2 level in primary cortical
neurons treated with Aβ25-35( ± s , n=3)
Aβ25-35 increased the H2O2 level in neurons. However, the H2O2 level in the neurons pre-incubated in 10 mmol·L-1 NAC for 24 h and co-incubated in Aβ25-35 for 12 h was lower than in those treated with Aβ25-35 alone. **P<0.01 vs Aβ25-35 group.
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线粒体膜内外的电位差是线粒体维持自身功能的需要。当这种电位差下降，提示线粒体功能的下降。所以，测定线粒体膜电位是反映线粒体功能的一个重要指标。如Fig4所示，神经元经Aβ25-35作用12 h后，线粒体膜电位就明显下降，这提示线粒体功能下降；另外，先经NAC预先孵育24 h后，再与Aβ25-35共同作用12 h后，相对于Aβ25-35组，线粒体膜电位则明显升高，提示线粒体功能有所改善。
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Fig.4
NAC attenuated decreasing of neuronal mitochondrial
membrane potential induced by Aβ25-35( ± s , n=3)
The mitochondrial membrane potential level decreased in the cortical neurons treated with Aβ25-35. However, the mitochondrial membrane potential level in the neurons pre-incubated in 10 mmol·L-1 NAC for 24 h and co-incubated in Aβ25-35 for 12 h was higher than in those treated with Aβ25-35 alone. *P<0.05 vs Aβ25-35 group.
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ATP是线粒体产生的，因此ATP的水平也反映线粒体的功能状态。由Fig5 可见，与空白对照组相比较，Aβ25-35作用后ATP的水平明显下降。这也提示Aβ25-35可抑制线粒体功能。然而，与Aβ25-35组相比较，NAC预先孵育后，再与Aβ25-35共同作用组中，ATP水平有一定程度的升高。这说明NAC具有保护线粒体功能的作用。
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Fig.5
NAC increased ATP level ( ± s , n=3)
Exposed to Aβ25-35, the ATP level decreased. However, the ATP level in the neurons pre-incubated in 10 mmol·L-1 NAC for 24 h and co-incubated in Aβ25-35 for 12 h was higher than in those treated with Aβ25-35 alone. *P<0.05，**P<0.01 vs Aβ25-35 group.
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氧化应激损害是AD病理生化改变的重要组成部分，它与AD广泛的生化病理改变密切相关[9, 10]。另外，导致AD病理改变的Aβ可诱导神经元氧化应激的产生。大量研究发现通过抗氧化治疗可保护神经元，但是其中机制并未完全阐明。NAC是一种常见的抗氧化剂，具有神经保护功效。我们前期研究发现，NAC可减轻神经元内Cdk5作用，减轻神经元内tau蛋白的过度磷酸化。所以，在本文中探讨NAC 对Cdk5的上游调节蛋白calpain活性的影响。
根据前期的研究基础，我们仍然继续使用20 μmol·L-1的Aβ25-35作用于皮层神经元12 h[8]，然后测定calpain活性。同样根据我们的前期研究，我们选择预先用10 mmol·L-1的NAC孵育24 h，然后与20 μmol·L-1的Aβ25-35共同作用12 h的方式来探讨NAC的可能作用。
我们使用荧光法测定calpain活性，研究发现NAC可降低Aβ25-35诱导的细胞内calpain活性的水平。 那么，NAC是通过什么途径来降低calpain的活性？大量研究证明，无论是AD患者或是Aβ的毒性损害，神经元内的线粒体皆有不同程度受损，并且有大量的氧自由基的堆积、线粒体膜电位下降和细胞内ATP水平明显下降。这些细胞内的改变和线粒体损害是一致的。
正常细胞质内的钙离子浓度远远低于细胞外或细胞内的内质网。但是，维持这种钙离子的浓度差是需要ATP参与的。当线粒体功能受损，ATP生成受阻。当产生的ATP不足以维持钙离子浓度差的时候，细胞质内的钙离子浓度就会不断升高。升高的钙离子浓度反过来激活钙依赖的蛋白激酶(如calpain)[11, 12]，从而使得细胞损害进一步加剧，最终导致细胞的死亡。另外，线粒体与内质网能进行相互影响，线粒体功能异常可影响到内质网功能，加剧细胞钙离子浓度的紊乱[12]。所以，保护线粒体功能，能够维持细胞质内的钙离子浓度，维持细胞稳态，抑制钙依赖的蛋白激酶calpain活性升高，保护神经元。
因此，为了能比较全面检测线粒体的功能，我们测定了细胞内的H2O2水平和线粒体膜电位及神经元内的ATP水平。结果提示，Aβ25-35作用12 h，线粒体膜电位和细胞内的ATP水平明显下降，而细胞内的H2O2明显升高；而NAC预先孵育后的神经元内线粒体膜电位和ATP水平是有所升高的，H2O2则明显下降。这些结果提示NAC可保护线粒体，提高细胞内的ATP水平。
综上所述，Aβ25-35可损害细胞内线粒体的功能、降低ATP水平、激活calpain活性；而NAC可改善线粒体功能、增加ATP的水平、减轻异常激活的calpain的活性。这些研究可为抗氧化剂治疗AD提供有价值的实验基础。
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