2. 华北理工大学冀唐学院, 河北 唐山 063000;
3. 华北理工大学医学中心实验室, 河北 唐山 063000
2. Jitang College of North China University of Science and Technology,Tangshan Hebei 063300,China;
3. Medical Experiment Research Center of North China University of Science and Technology,Tangshan Hebei 063000,China
近年来,部分以p53为靶点的化合物研究推动着蛋白相互作用和蛋白突变体构象领域药物的新发现[1],但有关中药单体分子对神经细胞退行性变过程中p53及其相关基因变化的研究尚不多见。本研究在前期相关实验基础上[2, 3, 4],采用MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡模型,进一步探讨葛根素是否通过调节p53及mir-34a表达来影响多巴胺神经细胞凋亡。
1 材料与方法 1.1 细胞株SH-SY5Y细胞株购自中国医学科学院细胞中心。
1.2 主要药物与试剂葛根素(中国食品药品检定研究院,纯度为96%)。MPP+、Annexin-V/PI和Pifithrin-ɑ(Sigma);DMEM/F12=1:1培养基、胰酶、胎牛血清(Gibco);GADPH抗体(华安生物),p53抗体(Cell Signaling Technology);SYBR Green qPCR和反转录试剂盒及引物(Invitrogen),引物序列见Tab1。
| Primer name | Sequences |
| GSP is the specific primer corresponding to miRNA,R is matched with the RT primer。 | |
| u6 | RT primer 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′ |
| Forward primer 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′ | |
| Reverse primer 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′ | |
| mir-34a | RT primer 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACAACCA-3′ |
| GSP 5′-GGGGGAATGGCAGTGTCT-3′ | |
| R 5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′ | |
| β-actin | Forward primer CTTTGAGTTCGGTGGGGTCA |
| Reverse primer GGGCCGTACAGTTCCACAAA | |
| p53 | Forward primer TTTTCCCCTCCCATGTGCTC |
| Reverse primer CAGTCTGGCTGCCAATCCA | |
CO2培养箱、凝胶成像系统及CFX96 Real-Time Systerm(Bio-Rad),倒置显微镜(Olympus),超净工作台(苏州净化设备厂),低温高速离心机(Hitachi),流式细胞仪(FACS Calibuar,BD)。
1.4 细胞培养及分组SH-SY5Y细胞接种于培养瓶中,DMEM/F12培养基(含10%的胎牛血清,青霉素1×105 U·L-1,链霉素100 mg·L-1),置于37℃、5%CO2培养箱培养。实验分对照组,MPP+模型组,葛根素低、中、高(50、100、150 μmol·L-1)+MPP+处理组以及Pifithrin-ɑ+MPP+处理组,共6组。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡细胞用低、中、高剂量的葛根素及40 mg·L-1的Pifithrin-ɑ预先作用3 h后,加入1 mmol·L-1的MPP+继续培养24 h,消化,收集,PBS清洗,加入400 μL Annexin V-FITC结合液重悬,加5 μL Annexin V-FITC染料,室温避光孵育15 min,加10 μL的PI染色液,室温避光孵育5 min,上机检测。
1.6 Western blot检测p53蛋白的表达提取蛋白,测浓度,蛋白变性,SDS-PAGE电泳,转膜,抗体孵育,ECL显色,Image J软件对结果进行分析。
1.7 RT-PCR检测p53及mir-34a基因的表达提取RNA,测RNA浓度,按反转录试剂盒进行cDNA合成,用CFX96 Real-Time Systerm仪进行RT-PCR扩增,实验结果应用CFX软件分析。
1.8 统计学分析用SPSS 17.0软件进行统计分析,数据均用
表示,多组间比较用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。
显微镜下观察,模型组细胞大部分细胞回缩,突起结构减少,细胞变圆,贴壁细胞减少;而葛根素预处理和给予Pifithrin-ɑ干预的细胞形态与模型组比较均有明显改善。
2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡本次试验结果与前期的统计分析结果基本趋于一致[4],葛根素可抑制MPP+引起的细胞凋亡,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05);给予Pifithrin-ɑ阻断p53基因表达后,细胞凋亡率与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。
2.3 Western blot检测p53蛋白表达模型组与对照组比较,p53蛋白的表达量明显升高(P<0.05),而给予葛根素干预后,p53蛋白的表达量又随葛根素浓度的增高逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。并且,给予Pifithrin-ɑ干预后,p53蛋白表达与模型组比较也明显降低(P<0.05)。
2.4 RT-PCR检测p53、mir-34a基因表达本次检测p53基因表达结果与前期结果也基本相同,具有统计学分析的一致性[4];加入p53抑制剂后,p53基因表达与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组mir-34a基因表达量与对照组比明显升高(P<0.05),给予葛根素干预后,随葛根素浓度的增加mir-34a基因表达量与模型组相比又明显降低(P<0.05);给予p53抑制剂阻断p53基因激活后的mir-34a基因表达量和模型组比较明显下降(P<0.05),见Tab2。
,n=6)
| Group | p53 gene | mir-34a gene |
| #P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group. | ||
| Control | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
| MPP+ model | 1.79±0.08# | 2.02±0.16# |
| Pifithrin-ɑ | 1.10±0.02* | 1.24±0.24* |
| 50 μmol·L-1Pue+MPP+ | 1.66±0.03* | 1.64±0.14* |
| 100 μmol·L-1 Pue+MPP+ | 1.35±0.10* | 1.45±0.25* |
| 150 μmol·L-1 Pue+MPP+ | 1.19±0.04* | 1.31±0.20* |
研究表明,miRNA-34家族作为p53的直接调控因子参与了细胞分化、凋亡和衰老等生物学进程,结合有关实验分析,mir-34a是受p53激活表达水平较高的miRNA。本研究结果,MPP+使细胞中p53蛋白及p53mRNA的表达增高,且mir-34a基因表达也增高。而加入p53抑制剂干预后的细胞,mir-34a基因表达下降,可能是由于p53水平的降低影响了mir-34a的活性。目前研究发现,mir-34a能够通过E2F3和SIRT1上调p53,从而形成p53-mir-34a正向反馈调节环路[5, 6]。后期我们将继续进行相关实验,进一步研究p53与mir-34a的反馈调节关系。
3.2 葛根素保护PD的研究近年来,研究发现葛根素可以抑制由H2O2氧化引起的细胞凋亡[7, 8]。体、内外PD模型的相关研究表明,葛根素对p53表达具有一定调节作用[9],本结果证明葛根素能降低MPP+引起的细胞凋亡外,还从p53-mir-34a通路角度对葛根素抑制细胞凋亡的机制进行了一些初步新探索,结果显示,葛根素和p53抑制剂干预使得p53蛋白及p53和mir-34a基因的相对表达较MPP+模型组降低,提示葛根素有可能通过抑制p53转录从而减少mir-34a基因表达。
(致谢:本实验在华北理工大学医学中心实验室完成。感谢老师们实验过程中的耐心指导,使得本研究顺利完成。)
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