缺血性脑血管疾病(ischemic cerebrovascular disorders,ICVD)越来越成为威胁人类健康，影响生存质量的疾病之一^{[1, 2]}。人们近年来对脑缺血/再灌注进行研究发现诸多因素参与其中，包括氧化应激、炎症反应、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、细胞凋亡等。脑水肿是急性脑血管疾病后致命的并发症之一，脑缺血/再灌注后的脑水肿程度与AQP4的表达呈正相关。SIRT3参与多种细胞的能量代谢，氧化应激，细胞凋亡等过程，可提高细胞的抗氧化应激的能力。本课题组已从行为学、耐缺氧和生化技术等方面证实了大黄酚对小鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用^{[3, 4]}。本实验通过研究大黄酚对脑缺血/再灌注小鼠脑组织SIRT3和AQP4表达的影响，进一步探讨其神经保护作用机制，为临床治疗缺血性脑血管疾病提供理论基础和实验依据。

昆明种♂小鼠(SPF级)，体质量(20±2)g，由中国医学科学院实验动物中心提供。将实验用小鼠随机分为6组，药物组于缺血前30 min 分别腹腔注射大黄酚10.0,1.0,0.1 mg·kg^-1；空白对照组、假手术组和模型组于缺血前 30 min 腹腔注射溶剂10 mL·kg^-1。

大黄酚(Chrysophanol,Chry)，质量分数＞98%，(生产批号 110796-20130812，中国药品生物制品检定所)；Rabbit Anti-SIRT3 antibody(北京博奥森生物技术有限公司)；AQP4 Antibody、AQP4 mRNA原位杂交试剂盒、DAB显色剂(武汉博士德生物工程有限公司)；SOD测定试剂盒、MDA测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

ASP200S脱水机，生物组织包埋机，石蜡切片机，真彩病理图文分析系统均购自德国莱卡；HITACHI UV 9100紫外分光光度计：日本；Safire2多功能酶标仪：奥地利；Sigma3k30高速冷冻离心机：德国；CX21光学显微镜：OLYMPUS。

参照改良的Himori法^[4]制备小鼠脑缺血/再灌注模型。

采用免疫组化法测定脑组织中SIRT3和AQP4的表达；采用原位杂交法测定脑组织中AQP4 mRNA的表达，并严格按试剂盒说明书操作；采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，紫外分光光度计测定532 nm处吸光度，计算小鼠脑组织MDA含量。

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据以来表示，组间比较采用单因素方差分析及q检验两两比较。

结果显示：脑缺血/再灌注后SIRT3表达降低，AQP4表达增强；大黄酚可上调SIRT3的表达，下调AQP4的表达，与模型组比较差异具有统计学意义，见Tab1。

Table 1 Effects of chrysophanol on SIRT3 and AQP4 expression in brain tissue of mice induced by cerebral ischemia-reperfusion injury(,n=10)

Group	Dose/mg·kg-1	SIRT3	AQP4
**P<0.01 vs sham; #P<0.05,##P<0.01 vs I-R.
Control		25.43±2.67	2.79±1.07
Sham		27.65±3.00	3.06±2.67
I-R		15.32±2.08**	50.23±3.29**
I-R+Chry	0.1	42.33±4.59#	41.78±6.78##
I-R+Chry	1.0	48.16±5.19#	35.33±5.04##
I-R+Chry	10.0	60.50±2.34#	30.28±2.27##

表选项

结果表明，脑缺血/再灌注后AQP4 mRNA表达增强，大黄酚可下调AQP4 mRNA的表达，与模型组比较差异有显著性，见Tab2。

Table 2 Effects of chrysophanol on AQP4 mRNA expression in brain tissue of mice induced by cerebral ischemia-reperfusion injury (,n=10)

Group	Dose/mg·kg-1	AQP4mRNA
*P<0.05 vs sham; ##P<0.01 vs I-R.
Control		2.69±1.07
Sham		3.16±2.47
I-R		49.53±2.12*
I-R+Chry	0.1	40.18±6.38##
I-R+Chry	1.0	34.38±4.94##
I-R+Chry	10.0	29.15±3.25##

表选项

模型组小鼠脑内SOD活力明显降低，MDA含量明显升高；大黄酚组对脑组织SOD活力明显提高(10.0,1.0 mg·kg^-1 P<0.01,0.1 mg·kg^-1 P<0.05)，MDA含量明显降低(10.0,1.0,0.1 mg·kg^-1 P<0.01)，见Tab3。

Table 3 Effects of chrysophanol on SOD activity and MDA content in brain tissue of mice induced by cerebral ischemia-reperfusion injury (,n=10)

Group	Dose/ mg·kg-1	SOD/ kU·g-1·Pro	MDA/ μmol·g-1·Pro
	**P<0.01 vs sham; #P<0.05,##P<0.01 vs I-R.
Control		218.11±4.65	1.03±2.33
Sham		209.34±5.37	1.52±2.67
I-R		99.36±8.88**	7.82±4.07**
I-R+Chry	0.1	112.50±9.03#	6.03±6.88#
I-R+Chry	1.0	126.89±6.72##	5.13±7.39##
I-R+Chry	10.0	150.82±6.94##	4.45±2.40##

表选项

脑水肿是脑缺血/再灌注后非常明显的组织病理学表现，脑水肿的发生机制尚未完全阐明，实验研究表明^[5]，水通道蛋白(aquaporin,AQP)在脑缺血/再灌注后脑水肿的发生发展过程中起到重要作用。至今发现脑组织中存在3种水通道蛋白：AQP1、AQP4、AQP9，其中AQP4分布最广泛，功能最强大，参与许多水代谢障碍的调节过程，尤其是与脑缺血/再灌注之后的脑水肿形成的病理生理过程密切相关。有研究显示，AQP4在脑组织的水平衡中起到关键作用^[6]。本研究发现，脑缺血/再灌注后脑组织中AQP4的表达明显增加，而应用大黄酚后AQP4的表达明显减少，且大黄酚对脑缺血/再灌注后AQP4表达的抑制作用呈剂量相关性。

SIRT3位于线粒体，参与多种细胞的能量代谢、氧化应激、细胞凋亡等过程。在缺氧和氧化应激有关的疾病中起保护作用。Qiu^[7]等的实验结果显示：SIRT3通过去乙酰化超氧化酶歧化酶2(SOD2)上的赖氨酸残基，增强SOD2的活性，从而降低细胞中活性氧(ROS)水平，提高细胞抗氧化应激能力。本实验发现，脑缺血/再灌注后小鼠脑组织SOD活力明显降低，SIRT3表达水平明显下降，给予大黄酚后SOD活力及SIRT3水平均明显增强，且二者呈正相关性。我们推测大黄酚可能是通过SIRT3参与线粒体蛋白去乙酰化调节，激活SOD2，降低线粒体内的ROS水平，从而达到调节氧化应激反应，抑制细胞凋亡，起到神经保护作用。但大黄酚下调AQP4及上调SIRT3表达的机制目前尚不完全清楚，有待进一步研究。