2. 新疆维吾尔族自治区中医医院干部二科, 新疆 乌鲁木齐 830000;
3. 新疆医科大学中心实验室, 新疆 乌鲁木齐 830054;
4. 新疆医科大学基础医学院药理教研室, 新疆 乌鲁木齐 830054
2. Traditional Chinese Medical Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Second Deparment of cadres, Urumqi 830000, China;
3. Center Laboratory Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China;
4. Department of Pharmacology, Basic Medicial College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China
我国糖尿病患病人数和死亡率都居世界首位。2013年9月，中国研究人员在《美国医学会杂志》(JAMA)上报道，中国已成为糖尿病人口大国，成人糖尿病患者数量估计超过 1 亿[1]。糖尿病的最大危害在于能引起诸多慢性并发症[2]。如肝、肾等实质性器官的病变、视网膜病变、糖尿病心脑血管病变、糖尿病周围神经病变等。目前尚无治愈方法。两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria)是维吾尔族世代传承下来的一种养生、保健的可以药食两用天然植物，有清热解毒、活血化瘀和胃健脾之功效，新疆维吾尔医院也作为一种维药材应用[3]。现代药理研究表明，两色金鸡菊具有降压、降血脂、降糖的功效，两色金鸡菊醇提物具有一定的降压作用，可以改善SHR心室肥厚情况[4]，有研究报道，两色金鸡菊在葡萄牙作为降糖物质使用，其提取物可改善糖耐量，直接促进胰岛素的分泌[5]。有学者用两色金鸡菊和饮食控制对胰岛素抵抗大鼠进行给药，发现该方法能通过抑制糖原异生通路关键蛋白葡萄糖-6-磷酸酶和PEPCK的表达以及调节三羧酸循环关键酶(CS、SDHA和DLST)的mRNA或蛋白质水平能明显提高葡萄糖稳态[6]。本研究旨在通过给糖尿病模型鼠灌胃两色金鸡菊乙酸乙酯提取物来观察该提取物对SD糖尿病大鼠及其并发症的影响。
1 材料 1.1 药材与试剂新疆两色金鸡菊乙酸乙酯提取物中试冻干粉(药材由乌鲁木齐三高和药业有限公司提供，由新疆医科大学药学院天然药物化学教研室胡君萍教授鉴定为菊科金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt．，本实验所用的为其干燥的花序并由乌鲁木齐三高和药业有限公司提取并制成冻干粉)。二甲双胍片，中链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，批号82K1506)，血清胰岛素放射免疫试剂盒 (批号130420，购自北京北方生物技术研究所)。
1.2 动物SPF级SD大鼠，♂，体质量(250.0±5.0)g，新疆医科大学动物实验中心提供，生产许可证SCXK(新)2011-0004。饲养环境模拟自然昼夜条件，温度(2l±2)℃，湿度40％～45％，自由饮水。
1.3 主要仪器BS-120全自动生化分析仪；高效液相微柱糖化血红蛋白检测仪；KDC-2046型低温离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；罗氏血糖仪；电子天平(中山市衡新电子有限公司)；AB204．N型分析天平(梅特勒·托勒德)。
2 方法 2.1 动物造模与分组将周龄为11周的SD大鼠高糖高脂饲料诱导喂养3个月后，测量大鼠体重及随机血糖，腹腔注射1%链脲佐菌素35 mg·kg-1，1周后检测随机血糖，>11 mmol·L-1视为造模成功，按大鼠血糖体重值均衡随机分组。总共设6组，正常组(n=10)、模型组(n=9)灌胃0.5%的CMC-NA空白溶液，二甲双胍组(0.16 g·kg-1，0.5%的CMC-NA溶液溶解，n=10)，两色金鸡菊乙酸乙酯提取物组分高、中、低3个剂量组(0.6 g·kg-1，n=8;0.3 g·kg-1,n=6;0.15 g·kg-1,n=10)。正常组喂食普通饲料，其余各组喂食高糖高脂饲料，自由进水。各组大鼠每天灌胃1次，根据体重给药。连续灌胃给药4周。
2.2 指标测量每周称量大鼠体重，同时使用罗氏血糖仪检测大鼠随机血糖。干预4周后，用2.5％的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉。腹主动脉取血，取血后立即取少许全血用高效液相微柱仪检测糖化血红蛋白含量。分离血清后分装3份，置于-70℃冰箱冷冻。取一份血清，室温解冻，使用放射免疫法测血清胰岛素的含量。另取一份血清解冻后，使用全自动生化仪检测血清中TG、TC、HDL、LDL、AST、ALT、r-GT、TP、ALB、Urea、Crea、UA的含量。
2.3 统计学分析统计学方法采用SPSS 17．0软件包对数据进行处理。利用正常组与模型组比较证明造模成功；各给药组与模型组及阳性对照组进行比较，观察给药后糖尿病的改善情况。结果以
± s或 ± SE表示，计量资料运用单因素方差分析法进行比较。
正常大鼠体重呈现上升趋势,糖尿病大鼠体重整体在降低,且组间无差异，见Tab1。
| ( ± s,g) | |||||
| Group | Start value | 1 weeks | 2 weeks | 3 weeks | 4 weeks |
| Normal | 564.7±47.5 | 575.0±64.4 | 588.6±65.8 | 600.5±66.5 | 612.3±62.0 |
| Model | 465.2±53.0 | 418.4±50.0 | 406.7±40.2 | 371.4±66.3 | 360.0±65.5 |
| Metformin | 473.9±56.7 | 437.2±62.3 | 447.4±48.2 | 416.3±38.4 | 379.5±38.8 |
| High dosage | 469.0±55.8 | 431.8±65.9 | 431.4±56.5 | 407.3±58.9 | 372.6±51.5 |
| Middle dosage | 465.7±44.4 | 431.8±48.2 | 409.8±62.4 | 402.7±81.8 | 385.7±91.0 |
| Low dosage | 497.0±65.7 | 464.5±62.2 | 460.4±55.6 | 434.5±64.1 | 402.6±52.8 |
糖尿病大鼠的随机血糖存在波动，经方差统计分析两色金鸡菊低剂量组血糖与模型组，阳性药组，高剂量组，中剂量组分别相比较差异有统计学意义(P < 0.05)。见Tab2。说明在此模型下，两色金鸡菊乙酸乙酯提取物低剂量组对血糖的控制力最好，甚至优于二甲双胍的降糖效果。
| ( ± s,mmol·L-1) | |||||
| Group | Start value | 1 weeks | 2 weeks | 3 weeks | 4 weeks |
| *P < 0.05 vs model | |||||
| Normal | 5.62±0.50 | 5.87±1.21 | 6.00±0.54 | 4.91±0.77 | 7.26±0.86 |
| Model | 26.41±2.63 | 28.28±3.29 | 32.76±9.50 | 27.20±9.19 | 29.83±1.77 |
| Metformin | 26.46±2.77 | 27.43±6.03 | 30.25±4.32 | 29.24±9.62 | 28.21±3.75 |
| High dosage | 26.45±2.89 | 28.44±2.43 | 29.40±6.55 | 30.49±5.35 | 27.59±7.62 |
| Middle dosage | 26.46±2.70 | 27.99±7.09 | 28.11±2.69 | 26.54±8.06 | 31.03±1.72 |
| Low dosage | 26.37±2.59 | 28.40±2.74 | 26.97±5.27 * | 24.94±4.36 * | 22.61±7.13 * |
低剂量组的TG、LDL值与模型组的差异有统计学意义(P < 0.05)。其余各给药组的差异无统计学意义。
各给药组的AST、ALT、r-GT差异无统计学意义。见Tab4。
TP值低剂量组与模型组的差异有统计学意义(P < 0.05);ALB值高剂量组与模型组的差异有统计学意义(P < 0.05)。见Tab5。
| ( ± s) | |||
| Group | n | TP/g·L -1 | ALB/g·L -1 |
| *P < 0.05 vs model | |||
| Normal | 14 | 59.3±1.0 | 33.3±0.5 |
| Model | 10 | 87.9±10.8 | 24.0±3.1 |
| Metformin | 10 | 78.2±8.3 | 29.6±1.2 |
| High dosage | 7 | 71.5±8.5 | 30.7±3.2 * |
| Middle dosage | 6 | 98.8±16.0 | 19.8±5.5 |
| Low dosage | 13 | 61.8±3.3 * | 29.7±1.0 |
Crea值二甲双胍组，高剂量组、低剂量组与模型组的差异有统计学意义(P < 0.05)；UA值低剂量组与模型组的差异有统计学意义(P < 0.05)。见Tab6。
血尿素氮水平各组之间的差异无统计学意义(Tab7)。
| Group | n | Urea/mmol·L -1 |
| Normal | 14 | 6.5±0.2 |
| Model | 10 | 15.2±1.5 |
| Metformin | 10 | 12.5±1.7 |
| High dosage | 7 | 13.3±0.8 |
| Middle dosage | 6 | 11.5±1.8 |
| Low dosage | 13 | 13.4±1.3 |
血清胰岛素各组之间差异无统计学意义。糖化血红蛋白中剂量组与模型组的差异有统计学意义(P < 0.05)，见Tab8。
两色金鸡菊(雪菊)原产美国，在葡萄牙、中国等地栽培繁殖。同时在各生长国家都有流传，其有 不同的药用功效。近年来，在各国研究学者的努力 下不断完善了其所含主要成分及其生物活性。动物实验表明其对糖尿病、高血压等疾病有一定疗效，同时，其作用机制的研究也在逐步进行。本课题组前期动物实验表明，两色金鸡菊水提物灌胃能提高大鼠胰岛敏感性，改善胰岛素抵抗和血脂紊乱。张燕等[7]通过α-葡萄糖苷酶体外筛选模型，研究两色金鸡菊乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、总黄酮提取物、水提物及两色金鸡菊中性黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，其中两色金鸡菊中性黄酮的活性最强，酶抑制率高达87.26%,半数抑制浓度IC50为5.8 mg·L-1。有实验报道从两色金鸡菊中提取的黄酮类化合物能降低高血脂症小鼠的血脂且无肝功能损伤，有比非诺贝特更好的抗高脂血效果[8]。梁淑红等[9]采用高脂血症小鼠模型，探讨两色金鸡菊不同提取部位对血脂的影响，发现两色金鸡菊提取物均有明显的降血脂作用，以氯仿和乙酸乙酯萃取物作用最明显。本次实验在分组给药观测大鼠体重、随机血糖、糖化血红蛋白、血清胰岛素、肝功能及肾功能的改变情况，来评价两色金鸡菊对糖尿病大鼠的影响，为下一步对其作用机制的研究找出可能的作用点。
实验结果发现，两色金鸡菊乙酸乙酯提取物0.15 g·k·d-1可有效降低糖尿病大鼠的随机血糖和血清甘油三酯(Tab3)、低密度脂蛋白(Tab3)说明其具有降随机血糖和降血脂的效果。降低血清总蛋白(Tab5)，同时能升高血清白蛋白(Tab5)含量，说明其对肝脏功能有较好的保护作用。还降低了血清肌酐(Tab6)及血清尿酸(Tab6)的水平，血尿酸是评价肾脏受损的敏感指标，血肌酐是常用评价肾功能的指标之一，二者水平降低说明提取物对DM大鼠的肾脏功能有保护作用。0.3 g·kg-1·d-1的提取物可降低糖尿病大鼠的糖化血红蛋白(Tab8)，说明该剂量对DM大鼠血糖长期控制较好。0.6 g-1·d-1的提取物可升高糖尿病大鼠的血清白蛋白水平，提示其对肝脏的功能有保护作用。同时有效降低血肌酐水平，提示该剂量的提取物对肾脏功能有保护功能。观察5组糖尿病大鼠发现，两色金鸡菊乙酸乙酯低剂量组随机血糖控制较好(Tab2)，同时，其他4组大鼠体重下滑差值大而低剂量组体重控制较好(Tab1)，而且在实验期间死亡数最少，存活情况优于二甲双胍组，且该组老鼠的尿量和活动状态也较好。有国外实验表明，两色金鸡菊可促进胰腺功能的恢复，增加胰岛素的分泌量[10]，本实验结果表明两色金鸡菊乙酸乙酯提取物可促进胰岛素分泌，但与模型组比较无统计学差异。造成此结果差异的原因可能是因为造模程度的不同。兰怡等[11]用两色金鸡菊醇提物对实验性糖尿病大鼠灌胃给药发现，醇提物具有改善糖尿病大鼠血糖血脂紊乱的作用，将本实验数据与其相比较发现该实验糖尿病模型鼠胰岛素分泌比其正常组高约一倍，说明其模型偏向于胰岛素抵抗阶段的糖尿病，而本实验模型组血清胰岛素不到正常组的1/2，说明本实验模型组的大鼠处于胰岛素缺乏阶段，病情较重，所以并不能确定醇提物效果优于乙酸乙酯提取物。本实验中部分指标高、中、低剂量与效果的相关性不好，考虑原因可能有：① 两色金鸡菊乙酸乙酯提取物是混合物，成分复杂，所以量效关系并不明显，针对此问题后续将提纯提取物有效部位进行考察。② 药物浓度越高其副作用可能更高，以致没有显现出良好的剂量依赖。③ 剂量范围选择的问题，对甘油三脂及低密度脂蛋白的影响与梁淑红等[9]的结果一致。这些结果表明两色金鸡菊乙酸乙酯提取物可降低糖尿病大鼠随机血糖，血脂，可有效改善其肝脏、肾脏的功能，起到保护的作用，对糖尿病大鼠有治疗作用。
(致谢：本实验在新疆医科大学动物实验中心，新疆医科大学创新协同中心及新疆医科大学科技楼完成，在此特对以上实验中心和在实验过程中给予指导和帮助的老师表示感谢！)
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