缺血性心脏病是导致心脏病死亡的首要原因之一，占心脏病死亡人数的42%[1]。在急性心肌梗死后，使用血栓溶解治疗法或者直接经皮冠状动脉介入治疗而产生的早期心肌/再灌注是减小心肌梗死面积和提升临床治疗效果的有效策略。再灌注期间，持续的缺血使心肌损伤进一步恶化，因此产生再灌注损伤[2]。心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)可导致心肌细胞坏死、凋亡、心律失常和其他心脏功能障碍。心肌缺血/再灌注的病理生理过程涉及许多因素，机制十分复杂，主要有心肌功能紊乱、能量代谢失常、大量自由基的合成、胞内钙离子超载、血流动力学的改变、炎症反应的发生、嗜中性粒细胞渗透以及血管内皮功能紊乱等[1, 3]。
Rho家族是一类小G蛋白家族，具有GTP酶活性。目前发现的哺乳动物体内Rho蛋白已有23个，包括RhoA、Cdc42、Rac1等。Rho蛋白被认为是重要的信号转导分子已有20年之久，在细胞分裂、存活、迁移及黏附等过程中发挥重要作用。小G蛋白是G蛋白的一种，其共同特点是当结合了三磷酸鸟苷(GTP)时即成为活化形式，这时可作用于下游分子使之活化，而当GTP水解成为二磷酸鸟苷(GDP)时则恢复到非活化状态，在多种细胞活动中具有分子开关作用[4, 5]。
在众多的Rho蛋白中，研究最多的是RhoA。最初RhoA被认定为能有效调控细胞迁移的细胞骨架调节分子。随后大量实验研究表明，RhoA具有的影响力并不局限于在细胞迁移中调节肌动球蛋白收缩性，而是具有更广泛的其他功能，可作用于细胞生长中的基因表达，炎症反应中的内皮屏障紊乱，形态发生和肿瘤发生时上皮细胞连接的调控以及吞噬作用中的膜转运等。RhoA信号通路可通过多种细胞表面受体被上游分子激活，并通过已知的28个下游靶点调控靶细胞的结构和功能[6]。大量的研究表明，适当抑制或激活RhoA信号通路在MIRI中具有心肌保护作用，本文将对RhoA在MIRI中的调控作用及机制进行综述。
1 抑制RhoA/ROCK通路产生的心肌保护作用及调控机制RhoA作用于下游分子Rho相关蛋白激酶（Rho associated proteinkinase，ROCK），是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它是小G蛋白Rho的下游作用底物[7]。ROCK本身可以被Rho、鞘氨醇磷脂酰胆碱（sphingosylphorylcholine，SPC）、花生四烯酸、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等多个上游分子所活化，而Rho蛋白是其最主要、最直接的上游刺激信号。在许多以细胞活性为中心的信号转导途径中，ROCK发挥着决定性的作用[5]。
RhoA/ROCK信号通路在MIRI中发挥各种重要作用，如改善缺血心肌能量代谢、抑制炎症反应和细胞凋亡，产生拟心肌缺血预适应作用，调节内质网应激等。至今只有一个ROCK抑制剂——法舒地尔上市，但科研人员仍然期待会有更多的基于抑制ROCK活性的药物进入医药市场。
1.1 改善缺血心肌能量代谢心肌是高度依赖于有氧氧化供应能量的组织。心肌缺血是指心肌的供血量减少或心肌对氧的需求量增加超过其最大供血量，从而引起心肌代谢、功能和结构改变[8]。
在大鼠离体心脏缺血/再灌注模型中，发现使用ROCK抑制剂Y-27632后，ATP合酶的两个不同分子片段的体内含量降低，并趋于正常值，说明缺血/再灌注期间ATP合酶易于降解，而用Y-27632干预能够通过抑制RhoA/ROCK通路，抑制ATP合酶的降解，增强其活性，促进能量物质的合成[9]。各种体内外实验结果显示，三七皂苷R1能够防止能量异常化，抑制ROCK的活性，恢复线粒体ATP合酶δ亚基的表达，从而防止心肌缺血/再灌注引起的能量代谢紊乱，增加能量物质合成，最终减轻MIRI[10]，证明三七皂苷R1发挥类似于Y-27632的心肌保护作用。
所以，ROCK抑制剂可以通过抑制RhoA/ROCK通路，增强ATP合酶的活性，恢复ATP合酶δ亚基的表达，改善缺血心肌组织的能量代谢，恢复心肌的能量供应。
1.2 抑制炎症反应和细胞凋亡心肌缺血/再灌注期间，缺血部位通过释放炎症因子，引起心肌细胞凋亡，使心肌组织受到损伤。
小鼠动物实验发现，Y-27632能抑制缺血/再灌注期间Bcl-2的下调和前炎症细胞因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)、角质细胞诱导因子(keratinocyte chemoattractant，KC)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)的上调，从而抑制心肌细胞凋亡，缓解炎症反应，减小心肌梗死面积，改善心肌生化参数以及灌注后心肌功能[11]。其他动物实验结果也显示，法舒地尔能抑制MIRI诱导的前炎症细胞因子IL-6、CC趋化因子配体2(C-C motif chemoattractant ligand 2，CCL2)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的表达，减小梗死面积，减轻心肌组织的白细胞浸润，最终发挥保护心肌的作用[12]。
法舒地尔保护心肌的作用机制可能是，通过抑制RhoA/ROCK通路而降低c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)活性，减少细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)从线粒体向细胞核转运，并且JNK能调控AIF的转运，提示法舒地尔可通过作用于JNK调节的AIF转运而达到心肌保护作用[13]。在低氧诱导的心肌细胞凋亡模型中，其细胞凋亡水平、RhoA、ROCK1/2、磷酸化的磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、caspase-3的表达水平均比对照组高，而Y-27632可降低上述指标，说明其机制可能作用于RhoA/ROCK1/2/PI3K/Akt/caspase-3通路，产生心肌保护作用[14]。
因此，ROCK抑制剂可通过抑制RhoA/ROCK通路，减少MIRI期间前炎症因子的释放，减少炎症反应的发生。同时，其抑制JNK调控的AIF核转位，或通过RhoA/ROCK1/2/PI3K/Akt/caspase-3通路，抑制心肌细胞凋亡，保护缺血心肌。
1.3 产生拟心肌缺血预适应的作用心肌在经过短周期的缺血后能预防和消除随后长期有害的MIRI，即心肌缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)。预适应可以触发机体的保护机制，而“再灌注损伤补救激酶途径”(reperfusion injury salvage kinase，RISK)通路成为预适应保护机制的研究热点之一。RISK通路包括PI3K/Akt通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases/extracellular signal-regulated kinases，MAPK/ERK)信号转导途径，使核转录因子NF-κB增加，导致效应器的基因转录和表达增加，从而发挥抗MIRI的作用[15]。
ROCK抑制剂主要作用于PI3K/Akt通路，起到拟IPC的作用。从离体大鼠心脏缺血时开始，至再灌注10 min内，给予法舒地尔和Y-27632，均能减小心肌缺血面积，抑制心肌细胞凋亡，其机制可能与在再灌注初始阶段，抑制ROCK，激活PI3K/Akt/eNOS通路，从而达到保护心肌有关，说明再灌注期间，RhoA/ROCK通路的激活可能通过RISK通路而产生损伤[16]。在动物模型上，其他研究也进一步证实了这一机制[17]。
有研究证明，在MIRI早期，使用法舒地尔并不是通过激活ERK1/2而产生拟IPC作用，因此抑制RhoA/ROCK并不激活ERK1/2[18]。但另有研究证实IPC与ERK/MAPK通路存在联系，ERK/MAPK位于ROCK的上游。在心肌缺血/再灌注期间，预先处理而产生预适应作用的大鼠体内ERK1/2活性明显增加，并能降低ROCK活性，减少细胞凋亡数量。进一步的实验结果也表明，IPC激活ERK/MAPK信号通路，进而抑制ROCK，从而抑制体内细胞凋亡[19]。而上述两个研究结果并不矛盾，也不会影响以下结论：ROCK抑制剂产生拟IPC作用并不上调ERK1/2的活性。
因此，在再灌注初始期，ROCK抑制剂可通过抑制RhoA/ROCK通路，进而激活RISK通路中的PI3K/Akt通路，起到拟IPC的作用。
1.4 调节内质网应激细胞内Ca2+超载或应激产生的ROS是MIRI的重要机制。钙稳态紊乱可产生内质网应激，正常内质网功能受损，导致内质网内未折叠和折叠错误的蛋白质堆积，从而导致细胞凋亡。另外，内质网应激也与肌浆网钙ATP酶功能障碍有关[20]。
研究发现，在MIRI期间，法舒地尔可通过增加肌浆网钙ATP酶的活性来调节内质网应激，减小心肌梗死面积，从而保护心肌，其机制是通过抑制ROCK而共同作用于PI3K/Akt通路和JAK2/STAT3通路。此项研究强调，在MIRI早期，PI3K/Akt通路和JAK2/STAT3通路发挥同等重要的心肌保护作用。在MIRI后期，法舒地尔主要是作用于JAK2/STAT3通路，恢复受损肌浆网钙ATP酶的表达和活性，从而保护心肌[20]。其中，JAK2/STAT3通路包含于“生存活化因子增强(survivor activating factor enhancement，SAFE)”通路。
在MIRI后期，ROCK抑制剂可恢复受损肌浆网钙ATP酶的表达和活性，调节内质网应激，减小心肌梗死面积而保护心脏。ROCK抑制剂在MIRI后期作用于SAFE通路，是对RISK通路的一个重要补充。
2 激活RhoA产生的心肌保护作用及调控机制鉴于RhoA信号通路具有多重的上游及下游信号调节分子，近年来随着转基因技术的发展，许多文献资料报道了与以上研究相反的观点，即激活RhoA在心脏的生理病理过程中具有积极作用，此作用主要通过除ROCK之外其他不同下游信号分子发挥心肌保护作用[21]。
研究发现，RhoA较高水平的急性激活，能保护心肌细胞免受凋亡损害。新生大鼠心室肌细胞(neonatal rat ventricular myocytes，NRVMs)24h内的RhoA激活并不诱发细胞凋亡，并且可以在H2O2和低糖损伤诱发的细胞凋亡中起保护作用，此作用依赖于ROCK活性、黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)的激活。研究证实，NRVMs中的FAK通过作为一个蛋白支架对RhoA信号做出回应而发挥作用，同时招募PI3K的p85亚基，并激活Akt。机械牵张已被证实能在心肌细胞中激活RhoA，同时也可诱发FAK和Akt的活化。心肌细胞的FAK表达基因的敲除，可在MIRI中增加心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。表明心肌细胞中RhoA通过激活下游靶点FAK，从而发挥心肌保护作用[22]。
研究证明，利用转基因及基因敲除技术，建立持续性激活RhoA小鼠模型和RhoA基因敲除小鼠模型，并且RhoA的表达水平以不产生心肌肥大症状和心肌病为适宜，以此证实低水平持续性激活RhoA对体内外MIRI的保护作用。RhoA在低水平上的持续性激活，可以在MIRI中减小心肌梗死面积，减少LDH的释放，改善心脏功能参数，减少心肌细胞凋亡数量。在此过程中传统的RhoA下游分子，如活化的Akt、FAK、ERK、PKN以及iNOS、COX2、Bcl-2等并无明显变化，而PKD的磷酸化水平明显升高。因此，低水平持续性激活的RhoA可能通过RhoA/PKD信号通路在MIRI中发挥积极作用[21]。
在另一个探究1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1 phosphate，S1P)保护MIRI的作用机制的实验中发现，S1P可诱导活化RhoA的表达水平上升4-5倍，并利用RNA干涉的方法证实，磷脂酶Cε(PLCε)为S1P/RhoA的靶点而在S1P的保护作用中扮演重要角色，最终S1P通过RhoA和PLCε信号通路激活PKD。证明RhoA/PLCε/PKD通路是保护心脏的潜在的新通路[23]。
其他研究也证实，S1P通过激活RhoA可缓解在NRVMs上模拟的MIRI，减少细胞凋亡数量，并发现富半胱氨酸肝素结合蛋白61(cysteine rich heparin binding protein 61，CCN1)作为S1P的信号中介分子而起保护心肌作用。CCN1是一个多效性分子，在各种不同的刺激条件下可高水平表达。CCN1的功能包括，细胞迁移、增殖、分化、存活/凋亡和衰老等的调节。在细胞水平对S1P保护心脏的新机制研究结果显示，采用基因敲除技术和RhoA及其下游分子的激动剂或抑制剂，发现在MIRI模型中，S1P通过RhoA/MRTF-A信号通路激活CCN1，从而发挥心肌保护作用。离体心脏实验结果也支持了此机制的成立。所以在再灌注期间，RhoA和CCN1的早期激活，对保护心肌细胞将是一个新的治疗方法，并可控制心脏缺血/再灌注发展为心力衰竭和心肌重构[24]。
3 结语与展望目前更多的研究策略是通过抑制RhoA/ROCK通路而治疗包括MIRI在内的心血管疾病，研究热点主要集中在选择性ROCK抑制剂的研究和开发。众所周知，RhoA信号通路涉及多种上游和下游信号分子，而从上游可知，每条通路可能发挥着不同甚至相反的作用。所以单纯地激活或抑制RhoA的表达，并不能同时控制多条通路发挥不同作用。在不断发现不同的RhoA调控通路的情况下，在心肌缺血/再灌注的不同时期，针对性地、适宜地激活或抑制RhoA及下游信号分子的表达和活性，能够发挥有效的心肌保护作用。同时，研究和开发针对RhoA不同通路不同时期的MIRI治疗药物，可使药物治疗策略更加丰富，也可期待药物疗效的提高和副作用的降低。
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