IL-33通过与二型固有淋巴细胞(group 2 innate lymphoid cells,ILC2s)[1, 2]上的ST2和IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)结合[3]，参与多种过敏性疾病发病机制，是引发过敏性疾病的关键因素[4]。上皮细胞可经刺激产生IL-33，作用于ILC2s并使其产生Th2型细胞因子，促进Th2型过敏性疾病的发生，如过敏性皮炎[5]、哮喘[6]、过敏性鼻炎[7]等。利用小鼠变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis,ACD) 模型探索其在过敏性疾病不同时期表达水平，有助于了解变态反应的发病机制，同时为准确评价药物对IL-33的影响选择合适时期。
1 材料与方法 1.1 动物BALB/c♂ 小鼠，SPF 级，18～22 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，SCXK (京) 2012-0001。
1.2 试剂异硫氰酸荧光素(FITC，Sigma)，溶于丙酮/邻苯二甲酸二丁酯 (1 ∶ 1)中； Mouse IL-4、IL-5、IL-13、IL-33 Kit (eBioscience)； TRIzol (Invitrogen); ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo Fisher scientific); Quanti Fast SYBR Green PCR kit (Qiagen); Lineage Cocktail with Isotype Ctrl-FITC抗体 (BioLegend),ST2/IL33R-APC和CD25-PE抗体 (eBioscience)。
1.3 ACD模型的建立小鼠于d 0腹部剔毛，d 1、d 2腹部涂抹80 μL 15 g·L-1 FITC致敏，d 6右耳涂20 μL 6 g·L-1 FITC 激发，对照组涂等体积的溶剂。于d 3、d 5和激发后24 h (d 7)测量耳厚，计算耳肿胀度(右耳厚度-左耳厚度)，对激发后24 h的耳进行病理组织学检查。
1.4 耳组织细胞因子检测小鼠耳片制备25 g·L-1组织匀浆，用 ELISA 法测定IL-4、IL-5、IL-13及IL-33，并通过样本总蛋白定量来进行校正。
1.5 IL-33 mRNA的表达耳组织采用实时定量PCR方法检测。利用Primer Premier 5.0 软件设计小鼠IL-33引物，以GAPDH为内参。
1.6 ILC2s的检测收集引流淋巴结，制备单细胞悬液，调整细胞密度为1×1010~2×1010 cells·L-1。取100 μL细胞悬液，加入lineage cocktail antibody (20 μL/well)、0.2 μg CD25 抗体和0.2 μg IL-33R/ST2抗体，避光孵育15 min,经生理盐水洗涤2次后，重悬，过滤，上流式细胞仪检测。
1.7 统计学处理数据以 
± s 表示，应用GraphPad Prism 5.0统计软件，两组组间比较采用student-t检验。
小鼠在诱导初期[对照(5.8±9.1) μm,模型(-4.2±11.1) μm]及诱导相[对照(-1.7±6.1) μm,模型(0±5.5) μm]右耳未出现肿胀，经FITC激发，右耳肿胀度明显增加[对照(11.7±11.7) μm,模型(176.7±39.3) μm，P < 0.01]，且病理组织学检查发现，耳组织内有大量以淋巴细胞为主的单个核细胞和少许多形核细胞浸润，同时 IL-4[对照(60.6±18.4) ng·g-1，模型(110.9±27.6) ng·g-1，P < 0.01]、IL-5 [对照(157.2±64.4) ng·g-1，模型(269.1±36.1) ng·g-1，P < 0.01]、IL-13 [对照(36.3±10.9) ng·g-1，模型(151.4±18.1) ng·g-1，P < 0.01]水平明显升高，提示FITC可诱导小鼠形成Th2型ACD。
2.2 小鼠ACD模型各时期IL-33的表达诱导初期小鼠耳组织内IL-33水平较对照组明显升高[对照(457.4±323.3) ng·g-1，模型(1554.6±359.5) ng·g-1，P < 0.01]，提示在致敏初期即已产生大量IL-33。诱导相和激发期IL-33水平[对照(554.0±104.3) ng·g-1，模型(787.9±189.1) ng·g-1; 对照(546.5±90.4) ng·g-1，模型(722.2±90.4) ng·g-1]虽仍较高，但较诱导初期有所降低。
2.3 诱导初期耳组织中IL-33 mRNA的表达与对照组相比(1.72±0.73)，模型组小鼠IL-33 mRNA表达升高(2.96±1.69)，该结果与IL-33在此时期表达增多相一致。
2.4 诱导初期ILC2s百分含量与对照组相比(0.32±0.053)，模型组小鼠引流淋巴结内ILC2s百分含量明显升高(0.43±0.050,P < 0.05)，提示在诱导初期IL-33表达升高，并作用于ILC2s，继而发挥生物学效应。
3 讨论IL-33是重要的促过敏细胞因子。过敏性疾病患者及模型动物上皮组织均表达高水平的IL-33 [8]，其关键作用是诱导或激活2型免疫反应的效应细胞ILC2。FITC可诱导形成以Th2型细胞因子占优势的小鼠ACD模型[9]，在该模型诱导初期，IL-33水平明显升高，且ILC2s数量增加，表明IL-33高表达于ACD的诱导初期，并激活下游反应，促使过敏性炎症发生。
| [1] | Spits H, Artis D, Colonna M, et al. Innate lymphoid cells-a proposal for uniform nomenclature [J]. Nat Rev Immunol, 2013, 13 (2):145-9. |
| [2] | Neill D R, Wong S H, Bellosi A, et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity [J]. Nature, 2010, 464 (7293):1367-70. |
| [3] | Chackerian A A, Oldham E R, Murphy E E, et al. IL-1 receptor accessory protein and ST2 comprise the IL-33 receptor complex [J].J Immunol, 2007, 179 (4):2551-5. |
| [4] | Cayrol C, Girard J P. IL-33: an alarmin cytokine with crucial roles in innate immunity, inflammation and allergy [J]. Curr Opin Immunol, 2014, 31 : 31-7. |
| [5] | Imai Y, Yasuda K, Sakaguchi Y, et al. Skin-specific expression of IL-33 activates group 2 innate lymphoid cells and elicits atopic dermatitis-like inflammation in mice [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110 (34):13921-6. |
| [6] | Kondo Y, Yoshimoto T, Yasuda K, et al. Administration of IL-33 induces airway hyperresponsiveness and goblet cell hyperplasia in the lungs in the absence of adaptive immune system [J]. Int Immunol, 2008, 20 (6):791-800. |
| [7] | Haenuki Y, Matsushita K, Futatsugi-Yumikura S, et al. A critical role of IL-33 in experimental allergic rhinitis [J]. J Allergy Clin Immunol, 2012, 130 (1):184-94. |
| [8] | Saenz S A, Taylor B C, Artis D. Welcome to the neighborhood: epithelial cell-derived cytokines license innate and adaptive immune responses at mucosal sites [J]. Immunol Rev, 2008, 226 :172-90. |
| [9] | 郭立芳, 范卫新, 汤爱民. 两种变应原致小鼠变应性接触性皮炎的研究 [J]. 中华皮肤科杂志 , 2005, 38 (4): 229-31. Guo L F,Fan W X,Tang A M. Dinitrofluorobenzene and fluorescein isothiocyanate induced mouse model of allergic contact dermatitis [J]. Chin J Dermatol, 2005, 38 (4):229-31. |