2. 中国科学院近代物理研究所, 甘肃 兰州 730000;
3. 烟台大学生命科学学院, 线粒体与健康衰老研究中心, 山东 烟台 264005;
4. 滨州医学院中西医结合学院, 山东 烟台 264003
2. Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China;
3. Center of Mitochondrion and Healthy Aging, College of Life Sciences, Yantai University, Yantai Shandong 264005, China;
4. Shandong Key Laboratory of TCM Heart-spleen Foundation, Binzhou Medical University, Yantai Shandong 264003, China
胶质瘤(glioma)属于神经上皮源性肿瘤，是颅内最常见的原发性肿瘤，约占颅内肿瘤的60%[1]。在我国，胶质瘤的发病率居颅内肿瘤之首，是预后较差的肿瘤之一，病死率高。尽管目前临床上采用传统的外科手术，内科化疗，先进的放射治疗手段以及应用各种新型的抗癌药物，但胶质瘤患者预后效果不佳，患者多于明确诊断后1年内死亡[2]。因此，探索新的、更加有效的胶质瘤的治疗方案及方法具有十分重要的意义。
Pierce等[3]于1961年首次提出肿瘤的诱导分化治疗的理论。该理论认为肿瘤细胞在一定条件下，如应用诱导分化药物等，可以继续分化，甚至达到终末分化，成为正常细胞，从而治愈肿瘤。寻找一种新的低毒的天然的抗肿瘤成分，以增强常规的抗肿瘤药物治疗肿瘤临床效果是当前医学研究的重点和难点之一。
异甘草素(isoliquiritigenin，ISL)是甘草中的一种黄酮类化合物，具有广谱抗肿瘤[4]、抗氧化[5]、清自由基[6]等多种药理学作用。也有文献报道，ISL可能通过非竞争性钙拮抗作用松弛豚鼠气管平滑肌[7] ，可改善反复脑缺血/再灌注小鼠认知功能障碍[8]。大鼠 C6 胶质瘤细胞，它被认为是较完美的研究神经胶质细胞发育毒性的实验模型[9]。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形胶质细胞的标志蛋白[10]，通过检测它们的表达水平研究ISL对 C6 细胞的分化影响。本课题组相关研究表明，ISL可抑制白血病和黑色素瘤细胞增殖，并诱导其分化[11, 12]。由于ISL对中枢神经系统肿瘤作用的研究还少见报道，同时亦有研究表明其在神经保护方面亦有一定作用，因此，本实验选用ISL为研究对象，研究其对大鼠C6脑胶质瘤细胞的诱导分化作用。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂大鼠C6神经胶质瘤细胞购自中国典型培养物保藏中心(武汉)，由烟台大学线粒体与健康衰老中心传代保存；DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，美国Gibco公司；ISL(纯度98%)，江西本草天工科技有限公司；磺基罗丹明B(SRB)，上海晶纯生化科技股份有限公司；Giemsa干粉，北京拜尔迪生物技术有限公司；逆转录试剂盒，TaKaRa公司；引物合成，上海生工；GFAP抗体，美国 CST 公司。
1.2 仪器与设备AE31型荧光倒置显微镜,Motic公司；SpectraMax Paradigm型多功能酶标仪，美国美谷分子仪器有限公司；垂直电泳仪及转膜系统，北京六一仪器厂；PCR扩增仪,美国Bio-Rad公司；Tanon 5500凝胶成像系统,上海天能公司。
1.3 细胞培养及分组C6细胞培养于含10% FBS、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养传代。
异甘草素储备液：以DMSO 溶解ISL，配成浓度为100 mmol·L-1 的贮存液，-20℃保存备用。使用前以含1% FBS 的DMEM培养液稀释，使ISL的终浓度为20、30、40 μmol·L-1。
1.4 SRB法测定异甘草素对细胞生长的抑制效应异甘草素对C6细胞生长抑制效应测定采用SRB法。取对数生长期细胞，消化计数，调整细胞密度至5×104·mL-1,接种于96 孔板中，每孔体积200 μL，接种24 h后，弃去培养基，分别加入含终浓度为0、20、30和40 μmol·L-1异甘草素的培养基(含1% FBS)，于37℃培养72 h。细胞培养结束后，取出培养板，每孔加入50 μL预冷的三氯乙酸(TCA)溶液(30%，W/V)固定细胞，TCA的终浓度为10%，然后在4℃冰箱中放置1 h。各孔用去离子水洗涤5遍，自然晾干后，每孔加入100 μL 0.4%的SRB溶液(1%的乙酸配制)，静置染色30 min后，倒掉染液，用1%乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用100 μL Tris碱液(10 mmol·L-1，pH=10.5)溶解，在微孔板振荡器上振荡20 min，多功能酶标仪在540 nm波长下测量各孔的吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：
抑制率/%=(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100%
1.5 Giemsa染色观察细胞形态取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于含灭菌盖玻片的6孔培养板中，待细胞贴附到盖玻片后，吸去培养液，分别加入含不同浓度异甘草素的培养基，对照组用含1% FBS的DMEM 培养基，培养72 h，取出盖片，PBS洗涤2 次，用甲醇固定10 min，PBS 洗涤2 次，滴加Giemsa 染液显色5 min，自然晾干,二甲苯透明，甘油封片；于显微镜下观察并拍照。光镜下观察细胞核呈紫红色或蓝紫色，细胞质成粉红色。
1.6 平板克隆形成实验取对数生长期C6细胞接种于培养瓶，用不同浓度的异甘草素处理72 h，弃去培养液，用预冷PBS洗2遍，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮于含10% FBS的DMEM培养液中备用。将细胞接种于6孔板中，每孔200个细胞。置37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱，静置培养10 d。终止培养，弃去上清，PBS漂洗2次，甲醇固定10 min，弃固定液，Giemsa染色液染30 min，PBS冲尽多余染液，空气干燥。在倒置相差显微镜下观察集落形成情况并拍照。拍照并计算肉眼可见的集落数，最后计算克隆形成率。
克隆形成率/%=克隆数/接种细胞数×100%
1.7 RT-PCR检测GFAP mRNA表达参照文献[13]进行,检测异甘草素处理后GFAP mRNA的表达情况。取对数生长期的C6细胞消化制成细胞悬液，接种于中号培养瓶中，置于5% CO2、37℃恒温培养箱中过夜，待细胞贴壁。吸去培养液，换用含有不同浓度异甘草素的新鲜培养基，继续培养72 h后，用TRIzol试剂提取总RNA。逆转录反应体系扩增反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性40 s，不同引物选择不同温度，退火45 s，72℃延伸1 min，循环30次后于72℃延伸10 min，得PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳分离分析。用Tanon 5500凝胶成像系统拍照并分析产物条带的相对光密度值。表1为实验所需的引物序列：
| Gene | Primer sequence | Product length | Annealing temperature/ ℃ | Cycles |
| GFAP | F:5′-GGCGCTCAATGCTGGCTTCA-3′ | |||
| R:5′-TCTGCCTCCAGCCTCAGGTT-3′ | 326 bp | 50 | 30 | |
| β-actin | F:5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACA-3′ | |||
| R:5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′ | 285 bp | 55 | 30 |
取对数生长期C6细胞接种于培养瓶，用不同浓度的异甘草素处理72 h，弃去培养液，用预冷PBS 洗2 遍，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30 min，用细胞刮刀收集细胞，12 000×g离心30 min。取上清，BCA法测定裂解液中的蛋白浓度。取30 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，300 mA 电转移120 min 至PVDF膜，TBST 漂洗3次，将PVDF膜放入含5% BSA的封闭液中，置于水平摇床，室温孵育120 min。取出PVDF膜，放入含有5%BSA 的TBST 的小鼠GFAP 单克隆抗体一抗中(1 ∶ 1 000)，4℃冰箱孵育过夜，再用TBST 漂洗3 次，与辣根过氧化物酶标记二抗 (1 ∶ 5 000) 室温孵育2 h，漂洗后，用Tanon 5500凝胶成像系统拍照并分析蛋白产物条带的相对光密度值。
1.9 统计学分析实验数据用
± s表示，用 SPSS 22.0 统计学分析软件进行数据统计分析。以t检验进行组间统计学差异比较。
不同浓度ISL 处理C6细胞72 h，20 μmol·L-1 ISL处理即表现出对C6 细胞增殖的抑制作用，随着ISL浓度的增加，存活细胞数目逐渐减少，ISL对细胞的抑制作用逐渐增强，呈浓度依赖性。
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| Fig 1 Effects of ISL on proliferation of C6 cells |
光镜下观察，发现对照组胶质瘤细胞多数呈两极长梭形，有的呈多角形，胞质多，胞突短；而72 h ISL处理组细胞突起数目不同程度增多，细胞形态逐渐变细变长，ISL 20 μmol·L-1处理组(Fig2)中细胞形态即开始出现变化，细胞胞体变圆，胞体两端突起变细变长，但部分细胞突起细而短，有的细胞突起长度可达细胞胞体的数倍，与对照组相比，阳性延展细胞数差异具有显著性；随着异甘草素处理浓度的增加、作用时间的延长，阳性延展细胞越来越多，72 h ISL处理组可见细胞突起明显变长，ISL 40 μmol·L-1处理组细胞形态学改变较其他组相比最明显(Fig2A)。经吉姆萨染色后显微镜下观察，大鼠C6胶质瘤细胞胞质丰富，呈淡蓝色或深蓝色，有非特异性嗜天青颗粒(呈紫红色)，两极呈短梭形，胞突短，胞质丰富，如图2所示，ISL 处理后，细胞胞质变少，胞突明显变细变长，胞质呈紫红色。
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| Fig 2 Morphological transformation induced by ISL in C6 glioma cells (×200) A:Observed with phase contrast microscope;B:Observed after Giemsa stainning. |
ISL诱导C6细胞分化后，神经胶质瘤C6细胞会向星型胶质细胞分化，因而集落生成能力降低。对照组克隆形成出现早，数量多，直径大，克隆形成率高(36%)，20 μmol·L-1 ISL处理组克隆形成率为25%，与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.01)，40 μmol·L-1 ISL处理组克隆形成率为6%，与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.01)。
ISL处理组与对照组相比，其形成的集落的个数明显少于对照组的克隆数，其恶性程度降低，增殖能力下降，集落形成能力也减弱(Fig3)；统计细胞形成的平均集落数，可以看出，对照组细胞的克隆形成率36%，明显多于40 μmol·L-1 ISL处理组克隆形成率16%；ISL处理组最大与最小集落较对照组相比均明显变小，并且大多数细胞不能形成明显的集落，说明ISL使C6细胞分化。
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| Fig 3 ISL significantly reduced number of colony formation in C6 cells **P < 0.01 vs control |
采用 RT-PCR 方法，分析不同浓度的 ISL 对细胞分化相关蛋白GFAP mRNA表达情况的影响。结果如Fig4所示，不同浓度的 ISL(20、30、40 μmol·L-1)作用72 h后，能够诱导细胞分化相关蛋白GFAP mRNA上调，在 40 μmol·L-1 作用时，GFAP mRNA表达水平最高，与对照组相比差异有显著性 (P < 0.01)。
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| Fig 4 ISL significantly increased expression of GFAP mRNA in C6 glioma cells (n=3) **P < 0.01 vs control |
采用 Western blot 方法，分析不同浓度的 ISL 对细胞 分化相关蛋白GFAP表达情况的影响。结果如Fig5所示，不同浓度的 ISL(20、30、40 μmol·L-1)作用72 h后，均能够诱导细胞分化相关蛋白GFAP上调，与对照组相比差异均具有统计学意义(P < 0.01)。在 40 μmol·L-1 作用时，GFAP表达水平最高。
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| Fig 5 ISL significantly increased expression of GFAP protein in C6 cells **P < 0.01 vs control |
胶质瘤是脑肿瘤中发病率较高的一种肿瘤，其手术治疗效果不佳，容易复发，因此是神经肿瘤治疗的一个难点和热点。为了更好地探索胶质瘤的治疗策略，国内外学者探索从传统的中医药中寻找解决的办法。诱导分化是指恶性肿瘤在体内外分化诱导剂存在下，重新分化向正常方向逆转的现象。大量研究报道和体外实验表明，在某些诱导分化剂作用下，肿瘤细胞可被诱导分化，出现类似正常细胞的表型或恢复正常细胞的某些功能。
ISL是从中药材甘草中提取和分离得到的黄酮类化合物，在药用植物中广泛存在，研究表明其有多种药理学活性，是甘草所提取出来的黄酮类成分中研究较多的重要化合物之一[14]。异甘草素对其他系统肿瘤的抑制作用已经陆续有相关报道，而对中枢神经系统肿瘤作用的研究少见报道，所以本实验用 ISL 对胶质瘤细胞 C6 进行研究，探讨 ISL 的增殖抑制及诱导分化作用。
SRB比色法，主要用来检测细胞增殖情况。实验分别测定了 20、30、40 μmol·L-1的异甘草素，在72 h对 C6 细胞活性的影响。如Fig1所示，ISL 低剂量组(20 μmol·L-1)、24 h即开始表现出对C6 细胞生长有抑制作用，随着剂量的增加、ISL的抑制作用也加大，呈剂量效应(P < 0.01)。
本实验对 C6 细胞形态学观察显示,异甘草素在浓度为 20 μmol·L-1 时就对C6有抑制作用，ISL处理72 h后，对胶质瘤细胞的抑制作用呈浓度依赖性，倒置显微镜下观察可见，与对照组相比细胞两端变细变长的增多。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状，形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。如Fig3 所示，对照组克隆形成出现早，数量多，直径大，克隆形成率高，而ISL处理组克隆形成率低，与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.01)，且绝大多数不能形成有效克隆。
GFAP 是星形胶质细胞及其肿瘤的特异标志物，是胶质细胞特有的细胞骨架蛋白,它的表达对于维持胶质细胞的正常形态以及调节细胞的生长速度具有重要的作用,是判断胶质细胞分化程度的一个重要标准之一，它与分化程度呈正相关[15]。本实验采用检测 RT-PCR、Western blot鉴定ISL对C6的诱导分化作用，如Fig4和5所示，ISL 对C6细胞作用 72 h后，mRNA和蛋白水平的实验结果均显示 GFAP 的表达随着 ISL的作用剂量增加而增加，特别是 40 μmol·L-1 ISL处理组增加最明显(P < 0.01)。
课题组前期研究表明，NADPH氧化酶活化及活性氧生成介导了ISL诱导的HL-60细胞分化[16]。本研究证实异甘草素可诱导 C6 细胞向星形胶质细胞分化，但异甘草素是否通过调控细胞内氧化还原状态诱导C6胶质瘤分化，有待进一步研究。
综上所述，异甘草素能抑制大鼠C6胶质瘤细胞的增殖，并能诱导C6 细胞分化。本研究以传统中药材甘草的活性成分异甘草素作为研究对象，研究其在中枢神经系统肿瘤中的作用，并讨论其对细胞增殖和分化的影响，对于异甘草素的开发应用及异甘草素对中枢神经疾病及其他恶性肿瘤的分化治疗相关研究提供了一定的理论依据和实践基础，对新疆地区的甘草产业的发展有重要意义。
(致谢：本实验在烟台大学生命科学学院，线粒体与健康衰老研究中心完成，衷心感谢实验室全体教师的指导和同学的帮助！)
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