近年来，糖尿病发病率逐年增高。流行病学调查显示，70%以上的糖尿病病人死于心血管系统并发症。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病常见的并发症，心肌肥厚是其关键的结构改变。现有研究已证实，高糖血症和高胰岛素血症均可作为独立因素参与心肌肥厚的形成。目前对DCM的治疗主要集中在控制和调节血糖、血脂、血压等危险因素方面。虎杖苷(polydatin，PD)是从传统中药虎杖中提取的有效成分，有较高生物学活性。药理学研究和临床实践已证明，PD具有调节糖脂代谢、抗炎抗氧化、影响离子通道等作用，对心力衰竭、缺血/再灌注损伤、组织损伤等均有保护作用^[1]。但对于PD在糖尿病心肌肥厚中的作用，目前国内外未见报道。

过氧化物酶体增殖物激活受体β(peroxisome proliferator activated receptors-β，PPARβ)参与细胞的脂质代谢和葡萄糖利用，维持机体能量平衡，在代谢性疾病中具有重要的调节作用^[2]。我们利用高糖高胰岛素(high glucose and insulin，HGI)模拟糖尿病时高糖血症和高胰岛素血症环境对心肌细胞影响的研究中发现，PPARβ相关信号通路在糖尿病心肌肥大中具有重要作用^[3]。Alvarez-Guardia等^[4]报道，PPARβ激活可下调核转录因子κB (nuclear transcription factor-κB，NF-κB)的表达，从而抑制心肌炎症和肥大^[4]。诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)与一氧化氮(nitric oxide,NO)作为重要的炎症介质，是NF-κB重要的下游因子。本实验室PPARs配体的筛选研究发现，PD具有激动PPARβ受体的作用，可能是一个PPARβ激动剂^[5]。在四氯化碳和高尿酸引起的小鼠肝、肾损伤模型，PD可通过抑制NF-κB-iNOS信号通路产生保护作用，维持机体正常功能^{[6, 7]}。但关于PD在糖尿病心肌肥厚中的作用和该作用与PPARβ以及NF-κB-iNOS-NO信号通路的关系未见报道。

故本研究拟利用HGI诱导乳鼠心肌细胞肥大模型，观察PD对糖尿病心肌肥大的影响，并探讨PPARβ及NF-κB-iNOS-NO信号通路在其中可能存在的作用。

SD乳鼠，清洁级，1～3 d龄，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)2010-0001。

PD (白色粉末，HPLC 95%，溶于1%DMSO)、GSK0660、5′-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷 (5′-Bromo-2-deoxyuridine,5′-BrdU) 均购自Sigma-Aldrich；胰蛋白酶、蛋白酶抑制剂、DMSO、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自江苏碧云天生物工程研究所；DMEM和胎牛血清购自Hyclone；NOS活性及NO含量检测试剂盒检均购自南京建成生物工程研究所；TRIzol购自大连宝生物公司；逆转录试剂盒和SYBR-Green Supermix购自Bio-Rad；PCR引物由Invitrogen公司负责合成和纯化；兔抗大鼠PPARβ、iNOS多克隆抗体购自Cayman Chemical Company；兔抗大鼠phospho-NF-κB p65多克隆抗体购自Cell Signaling Technology；兔抗大鼠GAPDH，山羊抗兔 IgG/HRP 二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

用胰蛋白酶消化法将乳鼠心室肌消化成单细胞悬液，差速贴壁分离1.5 h。将未贴壁心肌细胞用含20%胎牛血清的DMEM悬浮，调整不同细胞密度，分别接种于6孔板(用于检测细胞表面积及总蛋白测定)或于25 cm²培养瓶内(用于mRNA提取及检测)，置于37℃、5% CO₂培养箱中。18～30 h后见细胞贴壁生长，48 h细胞出现自发搏动。培养初始48 h加入5′-BrdU 0.1 mmol·L^-1抑制非心肌细胞生长，然后更换培养液继续培养24 h，至72 h换无血清培养液并加入相应药物，继续孵育48 h后用于检测。分组如下：(1) Control组：葡萄糖5.5 mmol·L^-1+甘露醇20.0 mmol·L^-1；(2) HGI组：葡萄糖25.5 mmol·L^-1 + 胰岛素0.1 μmol·L^-1；(3)、(4)、(5) HGI + 不同浓度PD (0.1、1、10 μmol·L^-1)组；(6) HGI+PD 1 μmol·L^-1 + GSK0660 1 μmol·L^-1组。

取6孔板内长有心肌细胞的玻片，PBS清洗3次后，相差显微镜下观察拍照，应用Image J图像分析系统(美国国立卫生研究院)测量计算单个细胞的表面积，每张玻片取5个视野，每个视野15～20个细胞，取平均值。每组重复4次。

将6孔板内培养好的心肌细胞用PBS清洗3次后，置于冰上加入RIPA裂解液，充分搅动裂解5 min后转至EP管中，超声破碎3 min，存放于-80℃。BCA法测定总蛋白含量，并根据接种细胞数目计算心肌细胞的蛋白含量。每组重复4次。

用TRIzol提取心肌细胞总RNA，参照GenBank中大鼠的基因序列设计引物。各引物序列如下：ANF：上游5′-GAGTGAGCCGAGACAGCAAA-3′，下游5′-TTGCTCCAATATGGCCTGGG-3′，扩增产物长度122 bp；PPARβ：上游5′-CTGGCAGAACCCAGTACCAG-3′，下游5′-GTGAGCCGGTGTCATGGTTA-3′，扩增产物长度111 bp；NF-κB：上游5′-AACGCGTCCAACCTGAAGAT-3′，下游5′-TGTCTGTGAACATCCGTGGG-3′，扩增产物长度188 bp；iNOS：上游5′-TGGTGAGGGGACTGGACTTT-3′，下游5′-CCAACTCTGCTGTTCTCCGT-3′，扩增产物长度101 bp；β-actin：上游5′-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′，下游5′-ACGCAGCTCAGTAACAGT CC-3′，扩增产物长度101 bp。按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，利用SYBR Green 荧光技术，在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪上按照如下反应条件进行扩增：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。以β-actin为管家基因，Ct值(荧光强度到达阈值时的循环数)为统计参数，mRNA的表达倍数采用2^ΔCt表示，相对定量法分析结果。每组重复4次。

取30 μg总蛋白加入含β-巯基乙醇的上样缓冲液，高温煮沸10 min使蛋白变性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF转膜，BSA封闭1 h，加入不同一抗(PPARβ抗体1 ∶ 200稀释，其它一抗均1 ∶ 1 000稀释)，4℃过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶ 5 000稀释)。洗膜后用ECL发光液(Advanstor公司)显色，凝胶成像仪与Image Lab软件(Bio-Rad)照相显影，分析结果。每组重复4次。

取30 μL上清液，按照试剂盒说明书操作，分别在530 nm和570 nm波长下测定吸光度(A值)，根据公式[总NOS活力 (kU·L^-1)=(总NOS活力测定管A-空白管A)×26.1/0.383×1.5]计算NOS活性，或根据标准曲线计算NO含量。每组重复3次。

应用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析整理，数据均采用 ± s 表示，两组间比较采用t检验，用Excel和GraphPad Prism 5.01等软件作图。

细胞形态学检测可见，加入HGI后，心肌细胞明显增大(Fig1)，细胞表面积、总蛋白含量和ANF mRNA表达亦明显增加(P<0.01)(Tab1)，提示心肌细胞肥大。若以平均值计算，HGI处理后，细胞表面积增加了3.49倍，蛋白含量增加了1.99倍，ANF mRNA表达增加了3.89倍。

Fig 1 Morphological changes of cardiomyocytes (200×) HGI: high glucose 25.5 mmol·L-1 and insulin 0.1 μmol·L-1; PD: polydatin

图选项

Tab 1 Effects of polydatin (PD) on the hypertrophic cardiomyocytes induced by glucose at 25.5 mmol·L^-1 and insulin at 0.1 μmol·L^-1(HGI) ( ± s , n=4)

Group	Cell surface area(μm2/cell)	Protein level(μg/106 cells)	ANF mRNA level
**P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs HGI; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01 vs HGI+PD (1 μmol·L-1).
Control	258.9±47.9	16.8±2.8	0.97±0.24
HGI	903.3±149.7** 33.4±7.3**	3.77±0.48**
HGI+PD (0.1 μmol·L-1)	438.8±33.3##	25.6±2.3#	—
HGI+PD (1 μmol·L-1)	404.0±25.2##	24.3±1.9#	2.00±0.21##
HGI+PD (10 μmol·L-1)	378.2±34.4##	20.9±2.9##	—
HGI+PD+GSK0660 (1 μmol·L-1)	902.1±104.1▲▲	33.5±7.0▲	3.80±0.33▲▲

表选项

与HGI组比较，PD(0.1,1及10 μmol·L^-1)明显抑制HGI诱导的心肌细胞表面积和总蛋白含量的增加，其抑制率分别为51.3%、55.2%、58.0%(P < 0.01)和22.2%、26.2%、36.5% (P < 0.01)。 PD 1 μmol·L^-1明显抑制HGI诱导的ANF mRNA的表达，使其减少了48.0%(P < 0.01)。这些结果提示PD能够改善HGI诱导的心肌细胞肥大。PPARβ阻断剂GSK0660 1 μmol·L^-1完全阻断等摩尔浓度的PD对HGI诱导的心肌肥大的作用(P < 0.01)，各指标基本接近HGI模型组水平(P＞0.05)。

与对照组比较，在HGI作用下，PPARβ的mRNA和蛋白表达分别降低了8.3%和38.1%(P < 0.05)。而NF-κB p65、iNOS mRNA及蛋白的表达明显上升，分别增加了172.6%、390.1%(P < 0.01)和60.8%、104.9%(P < 0.01)。PD 1 μmol·L^-1明显逆转HGI下调的PPARβ mRNA和蛋白表达(P < 0.05)，使PPARβ表达明显增加，甚至高于正常对照组(P < 0.01)；同时，PD 亦明显减少HGI上调的NF-κB p65、iNOS mRNA和蛋白表达(P < 0.01)。GSK0660(1 μmol·L^-1)完全取消等摩尔浓度的PD的上述作用，使PPARβ、NF-κB p65和iNOS的表达均接近于HGI诱导时的水平(P＞0.05)(Fig2，Fig3)。

Fig 2 Effects of PD on mRNA expressions of PPARβ, NF-κB p65 and iNOS in cardiomyocytes induced by glucose at 25.5 mmol·L-1 and insulin at 0.1 μmol·L-1(HGI) ( ± s , n=4) #P<0.05, ##P<0.01 vs control; **P<0.01 vs HGI; ▲▲P<0.01 vs HGI+PD (1 μmol·L-1).

图选项

Fig 3 Effects of PD on protein expressions of PPARβ, p-NF-κB p65 and iNOS in cardiomyocytes induced by glucose at 25.5 mmol·L-1 and insulin at 0.1 μmol·L-1 (HGI) ( ± s , n=4) ##P<0.01 vs control; **P<0.01 vs HGI; ▲▲P<0.01 vs HGI+PD (1 μmol·L-1).

图选项

加入HGI后，心肌细胞的NOS活性升高，NO含量亦明显上升，较正常组分别增加了31.2%和65.0%(P < 0.01)(Fig4)。PD(1 μmol·L^-1)明显降低NOS活性和NO含量(P < 0.01)，二者较HGI组分别下降了24.2%和21.5%。GSK0660(1 μmol·L^-1)完全阻断PD对NOS活性和NO含量的调节作用(P < 0.05)，使二者基本接近HGI模型组水平(P＞0.05)。

Fig 4 Effects of PD on the NOS activity (A) and NO concentration (B) in the cardiomyocytes induced by glucose at 25.5 mmol·L-1 and insulin at 0.1 μmol·L-1(HGI) ( ± s , n=3) **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs HGI; ▲▲P<0.01 vs HGI+PD (1 μmol·L-1).

图选项

2型糖尿病人群研究表明，糖尿病患者心脏左 心室壁厚度、室腔及重量日益增加，出现左心室肥大。同时，心脏舒张期顺应性降低，射血分数减少，舒张功能障碍，继而出现收缩期功能障碍^[8]。心肌肥厚是糖尿病患者常见的心血管并发症。本实验采用葡萄糖25.5 mmol·L^-1和胰岛素0.1 μmol·L^-1 模拟糖尿病时高糖高胰岛素血症环境，建立糖尿病心肌肥厚离体细胞模型。结果显示，心肌细胞表面积、总蛋白含量和心肌肥厚标志性基因ANF mRNA表达均明显增加，提示HGI诱导出现心肌细胞肥大。

PD是从传统中药虎杖中提取的有效单体，在红葡萄酒、啤酒花、花生、巧克力等许多日常食物中含量丰富。目前的研究显示，PD对血管紧张素Ⅱ或苯肾上腺素诱导的心肌肥大具有明显保护作用^{[9, 10]}，但对糖尿病引起的心肌肥大尚未见报道。本实验结果显示，PD明显减少HGI诱导增加的细胞表面积和蛋白总量，并减少ANF mRNA表达，提示PD对糖尿病心肌肥大可能也具有保护作用。

目前，糖尿病心肌肥厚的发病机制并不完全清楚。大量研究发现，肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病等的发生均与慢性轻度炎症密切相关^[11]。作为PPARs家族一员，PPARβ参与了代谢、炎症、增殖和分化等基因的调控。研究报道，PPARβ参与调节苯肾上腺素诱导的心肌肥大^[12]；我们之前的研究发现，PPARβ也参与了糖尿病心肌肥大过程^[3]。本实验结果显示，在HGI的作用下，模型组PPARβ在mRNA及蛋白水平表达均明显降低；给予PD干预后，PPARβ的表达则明显升高，甚至高于正常对照组，提示PD的作用可能是通过激动PPARβ来实现的。PPARβ特异性阻断剂GSK0660完全取消PD对心肌肥大的改善作用，同时使PPARβ表达恢复至HGI模型组水平，从另一个方面再次证实PD抗糖尿病心肌肥大的作用可能与其对PPARβ相关信号通路的激活有关。

在苯肾上腺素诱导的心肌肥大中，PPARβ激活后，可抑制NF-κB表达，从而保护心肌细胞^[13]；在感染性休克小鼠和肺癌细胞培养中也有类似发现，PPARβ激活调控NF-κB及其下游细胞因子的表达，保护组织器官的正常功能^{[14, 15]}。反之，在PPARβ基因敲除小鼠的心脏，NF-κB及IL-1β等炎性因子表达明显升高^[4]。这些结果提示，NF-κB可能是PPARβ作用的下游因子。作为重要的炎症调节介质，NF-κB能够调节多种参与炎症免疫反应的细胞因子和炎症介质的基因转录，iNOS是其重要的下游因子之一，在炎症反应和氧化应激中起关键作用^{[16, 17, 18]}。iNOS在正常的组织细胞中表达量很低；当受到内毒素、细胞因子等刺激后iNOS表达增加，合成大量NO。过量增加的NO是重要内源性炎症介质，参与炎症、氧化应激、高血压等多种心血管疾病相关的病理过程，在糖尿病慢性并发症中具有重要作用^[15]。在DCM病变中，NF-κB-iNOS信号通路激活则加重心肌组织损伤^[18]。本实验条件下，HGI作用使PPARβ表达被抑制，NF-κB则被激活，iNOS的表达量明显增加，NOS活性和NO含量随之增加，提示PPARβ-NF-κB-NO通路在糖尿病心肌肥大中亦具有重要作用。在小鼠高尿酸血症肾病模型和四氯化碳诱导的肝损伤模型，PD能有效抑制NF-κB、iNOS及IL-1β等多种炎性因子的表达，发挥抗炎抗氧化作用，维持肾组织和肝脏的正常功能^{[6, 7]}。在高糖作用的大鼠肾小球系膜细胞，PD亦显示了明显的保护作用，该作用与其对NF-κB信号通路的抑制密切相关^[19]。那么，PD糖尿病心肌肥大保护作用与NF-κB-iNOS-NO信号通路关系如何？目前未见报道。本研究结果显示，PD激活PPARβ表达同时，NF-κB的活化被抑制，iNOS的表达降低，NOS活性下降，NO释放减少，提示PD的抗糖尿病心肌肥大作用可能是通过激活PPARβ受体，抑制NF-κB-iNOS-NO信号通路的转导产生的。PPARβ受体阻断剂GSK0660取消PD糖尿病心肌肥大保护作用同时，完全取消PD对上述因子的作用，使PPARβ表达下降，NF-κB、iNOS表达、NOS活性和NO含量均恢复至HGI诱导水平，从另一个方面再次证实PPARβ-NF-κB-iNOS-NO信号通路在PD的抗糖尿病心肌肥大中可能具有重要作用。

综上所述，PD能有效抑制HGI诱导的心肌细胞肥大，其机制可能是通过激活PPARβ，抑制NF-κB，下调iNOS表达，最终减少NO过量生成而实现的。但PD在糖尿病心肌肥厚中的确切作用尚需整体动物模型证实及临床研究的进一步验证，其作用是否还有其它信号通路参与，亦需进行更深入的研究。

(致谢：本实验在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成，感谢实验室各位老师和同学在实验中提供的帮助。)