蛋白激酶D(protein kinase D,PKD)属于进化上高度保守的钙/钙调蛋白依赖性的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，其重要家族成员之一PKD1参与很多基础的生物进程调节，包括信号转导、细胞的增殖和分化、跨膜转运、分泌、免疫调节、心肌细胞的收缩、血管新生、肿瘤等[1]。特别是PKD1在肿瘤形成的进程中倍受关注，PKD1信号级联反应和胰腺癌、肝癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌等的发生发展密切相关[2]，其原因在于PKD1既可以直接促进癌细胞的增殖和分化，又促进癌细胞生长区域血管的新生。鉴于此，抗PKD1抑制肿瘤的方法在胰腺癌、乳腺癌等治疗中已经被提出，如特异的PKD1抑制剂CRT0066101可以明显抑制小鼠胰腺癌肿瘤细胞的增生[2]。
近年来，在缺血性心血管系统疾病的治疗中，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)疗法是潜在的最有希望的治疗策略之一，其可以被诱导分化为心肌细胞和血管平滑肌细胞[3]，实现缺血损伤心肌组织真正意义上的血管新生。PKD1既然可以促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织中血管的新生，那么是否也可能有促进EPCs黏附、迁移、增殖，诱导EPCs分化为血管的作用？本研究拟对此进行探讨并分析其可能作用机制，为以“PKD1”这一潜在可能靶点治疗缺血性心血管疾病提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物SD大鼠购自河南省实验动物中心，♂，清洁级，8周龄，重约200～240 g，动物生产许可证号：SCXK(豫)2010-0002，动物质量合格证号：1000142。
1.2 药物与试剂PKD1购自美国Pierce公司(生产批号为OSP00005W)，PKD1特异阻断剂CID755673购自美国MedChemExpress公司(生产批号为2011756)，DNA酶 I、Dulbecco′s PBS、FBS、胶原酶I、BrdU、BrdU鼠单克隆抗体购自上海宝曼生物科技有限公司(生产批号分别为LS002004、28374、SH30077、LS004194、83224、MMS-139S-250)；EBM-2培养基购自北京达科为生物技术有限公司(生产批号为CC-3156)；CD133、CD34、eNOS、VEGFR-2抗体购自天津恒业生物科技有限公司(生产批号为EL910835、EL162014、EL163112和EL171852)；羊抗兔IgG、DAB显色液购自武汉博士德生物工程有限公司(生产批号为TC1378、DD1660)；FN、FITC和DAPI购自北京碧橙蓝生物科技有限责任公司(生产批号为PA127507、PA185438和62247)；其它试剂为国产分析纯。
1.3 主要仪器A2-1389型生物安全柜(美国Thermo Scientific公司)；164-5052型PowerPac HC 电泳仪及FACSCanto II型流式细胞仪(美国BIO-RAD公司)；Bullet Blender Storm组织细胞破碎仪(美国Next Advance公司)；Nikon Tis型荧光显微镜及Nikon NIS-Elements Software BR分析系统(日本尼康公司)。
2 方法 2.1 EPCs的体外分离、培养和鉴定取体重为200~240 g的健康♂SD大鼠，颈椎脱臼处死后，75%乙醇浸泡10 min，无菌操作环境下取出胫腓骨，用含肝素及DNA酶 I的Dulbecco′s PBS反复冲洗骨髓，收集骨髓液，小心置入等量的淋巴细胞分离液之中，1 700 r·min-1离心30 min，无菌毛细吸管吸取分离液中间白膜层，5×PBS重悬细胞，离心后再用含2% FBS的EBM-2培养基重悬，按每平方厘米105个标准接种于培养板中，24 h后将未贴壁的细胞悬液转入预先用50 mg·L-1 FN包被的6孔细胞培养板中培养，3 d后换第1次液，之后每隔3 d换液1次，倒置显微镜下进行细胞形态学观察，7-10 d后，待细胞融合80%后，采用胶原酶Ⅰ消化后传代培养。对培养的内皮细胞观察其生长状态，分别在4、7、10、14 d照相并记录。对新分离的骨髓单核细胞进行滴片，于d 4、7、10、14取生长良好的原代细胞，重悬于PBS中，分别与EPCs细胞表面标记物CD133、CD34、VEGFR-2结合，再用FITC染色，DAPI 复染，检测上述标记物阳性表达的细胞。
2.2 PKD1对EPCs黏附的影响提前用50 mg·L-1 FN包被细胞培养板，每孔再接种5×104个EPCs，培养过夜，形成单皮层后转入无血清培养基培养5 h，用钙黄绿素标记EPCs后的制备单细胞悬液，37℃下孵育30 min。实验分5个组：A组，空白对照组；B组，25 μg·L-1 PKD1干预组；C组，50 μg·L-1 PKD1干预组；D组，100 μg·L-1 PKD1干预组；E组，PKD1(100 μg·L-1)+ CID755673 (100 μg·L-1) 干预组，以下简称CID755673干预组。每组设置6个复孔，实验重复3次。各组干预后，在37℃下、5% CO2孵箱中孵育30 min，用PBS轻轻冲洗细胞，去除未黏附细胞，倒置显微镜40×下，随机取6个视野拍照，计数黏附细胞个数，取平均值。
2.3 PKD1对EPCs迁移的影响用8 μm孔径的24孔transwell进行迁移实验，先分别在细胞小室的上、下室加入50 mg·L-1 FN，再注入含2% FBS的EBM-2培养基。然后在上室按照每孔2×104个的密度接种EPCs，在下层加入A组：空白对照EBM-2；B-D组：PKD1(25、50、100 μg·L-1)；E组：PKD1(100 μg·L-1)+CID755673 (100 μg·L-1)，每组设置6个复孔，实验重复3次。培养24 h后，用棉签擦去上室内的细胞，2%多聚甲醛固定，Giemsa染色，40×下随机取6个视野，倒置显微镜下计数迁移过膜的细胞数量，取平均值。
2.4 PKD1对EPCs增殖的影响将EPCs用含2% FBS的EBM-2的基础培养基重悬，每孔104个加入96孔培养板中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养，每孔加入终浓度为10 μmol·L-1的BrdU孵育。实验分组同“2.2”。分别在培养的24、48和72 h后，每孔加入100 μL的BrdU鼠单克隆抗体(1 ∶ 100)室温孵育1 h后，wash buffer冲洗2次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(1 ∶ 2 000稀释)孵育1 h后，wash buffer再次冲洗2次，加入100 μL TMB过氧化物酶底物室温避光孵育30 min，加入100μL终止液，酶联免疫检测仪450 nm波长处读取各孔吸光度值(A450)，取其平均值。
2.5 PKD1对EPCs血管形成能力的影响将EPCs用含2%FBS的EBM-2的基础培养基重悬，每孔5×104个加入Matrigel-Matrix预处理的48孔培养板中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养。实验分组同“2.2”。在培养的72 h后，40×倒置显微镜下观察管状结构数量，随机选择6个视野照相，取其平均值。
2.6 PKD1对EPCs中eNOS mRNA转录表达的影响将EPCs用含2%FBS的EBM-2的基础培养基重悬，每孔105个加入6孔培养板中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养。实验分组同“2.2”。在培养24 h后，TRIzol法提取EPCs总RNA，根据GenBank序列，分别设计eNOS的上下游引物为5′-CTGCTGCCCCAGATATCTTC-3′ 和5′-CAGGTACTGCAGTCCCTCCT-3′，产物长度为230bp。每组细胞取2μg总RNA，根据试剂盒的说明书逆转录合成cDNA，再取2 μg逆转录产物进行普通PCR，94℃，1 min，95℃，30 s，54℃，1 min，72℃，1 min，30个循环，延伸2 min。取反应产物10 μg进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后AlphaView SA软件摄图，并分析eNOS与β-actin基因的灰度比值。
2.7 PKD1对EPCs中eNOS蛋白表达的影响细胞培养实验设计同“2.6”。应用Next Advance Bullet Blender Storm组织细胞破碎仪将EPCs打碎，匀浆，4℃下12 000×g离心2min，提取组织总蛋白后Bradford法测定蛋白浓度，取其中20 μg蛋白进行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上，5％的脱脂奶粉封闭2 h后洗膜，标记1 ∶ 250稀释的eNOS一抗，4℃过夜，洗膜，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(1 ∶ 2 000稀释)孵育1 h后TBST洗膜，冲洗后暗室曝光显影。同时以β-actin蛋白表达水平作为内参对照。胶片经成像分析系统扫描，并应用AlphaView SA软件分析各样本与β-actin蛋白灰度的比值，记录蛋白相对含量。
2.8 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件系统，计量资料以
± s 表示，多组间均数比较比较用单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q检验。
EPCs结合FITC后呈现绿色，DAPI复染后胞核呈蓝色。EPCs呈卵圆形、纺锤形或者不规则状，CD133、CD34或VEGFR-2表达阳性，见Fig1。
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| Fig 1 Immunofluorescence detection of CD34 (A/D), VEGFR-2 (B/E) and CD133 (C/F) for EPCs (×200) Cells were counterstained with DAPI for nucleus (blue, D-F). |
和对照组相比，PKD1各干预组促EPCs黏附、迁移的能力明显增强(P<0.05)，且呈剂量依赖性(F黏附=21.323，F迁移=18.586，均P<0.05)。加入CID755673干预之后，EPCs的黏附、迁移的能力明显下降 (P<0.05)。见Fig2。
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| Fig 2 Effect of PKD1 on migration and adherence in EPCs *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 25 μg·L-1 PKD1 group; ▲P<0.05 vs 50 μg·L-1 PKD1 group. |
和对照组相比，24、48、72 h PKD1各剂量组促EPCs的增殖能力均明显升高(P<0.05)，且随剂量增加促增殖能力呈上升趋势；加入CID755673干预之后，EPCs的增殖能力明显下降 (P<0.05)。24、48、72 h时间组组间相比，随时间推移，PKD1各剂量组促EPCs增殖能力均明显升高(F时间=7.137，P<0.05)；且时间和剂量均明显影响EPCs增殖(F交互=10.098，P<0.05)。见Fig3。
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| Fig 3 Effect of PKD1 on proliferation in EPCs *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 25 μg·L-1 PKD1 group; ▲P<0.05 vs 50 μg·L-1 PKD1 group. |
与对照组相比，PKD1各干预组EPCs管腔样结构的数目明显增加(P<0.05)，且呈剂量依赖性增加趋势。加入CID755673干预之后，EPCs管腔样结构的数目明显减少(P<0.05)，且管状结构结点模糊。见Fig4。
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| Fig 4 Effect of PKD1 on numbers of tube-like structures in EPCs F=78.965, *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 25 μg·L-1 PKD1 group; ▲P<0.05 vs 50 μg·L-1 PKD1 group. |
和对照组相比，PKD1各干预组EPCs中eNOS mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)，和25 μg·L-1 PKD1干预组相比，50及100 μg·L-1 PKD1干预组EPCs中eNOS mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)，但后两组组间比较无差异；加入CID755673干预之后，EPCs中eNOS mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。见Fig5-6。
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| Fig.5 Effect of PKD1 on mRNA expression of eNOS in EPCs *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs 25 μg·L-1 PKD1 group. |
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| Fig.6 Effect of PKD1 on protein expression of eNOS in EPCs *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 25 μg·L-1 PKD1 group. |
本研究结果从PKD1激活和阻断两方面均证实PKD1明显促进EPCs的黏附和迁移，且呈剂量依赖性。这可能与PKD1对细胞间黏附分子l(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)和血管细胞黏附分子l(vascular cell adhesion molecule l，VCAM-1)的活化作用密切相关。ICAM-1和VCAM-1介导EPCs之间的黏附、趋化因子诱导的EPCs跨内皮的迁移，而黏附和迁移是归巢过程中的重要环节[3]。本研究结果同时证实，在24、48、72 h不同时间段，PKD1各剂量干预组均明显增加EPCs的增殖，且呈时间依赖性，时间和剂量方差交互分析证实两者均明显影 响EPCs的增殖。这表明，PKD1可以明显促进EPCs的增殖。进一步的研究结果表明，PKD1呈剂量依赖性提升EPCs的管腔样结构数量。之前的研 究证实EPCs向缺血组织归巢，分化为成熟的内皮细胞，并通过旁分泌的方式调控现存的内皮细胞，以一种和胚胎时期血管形成相似的方式分化成为血管内皮细胞，进而形成血管[4]。同时，PKD1还可以诱导生成多种生长因子，联合发挥作用，参与血管新生和组织再生的整个修复进程[5]。这和我们的研究结果高度吻合。这表明，PKD1可以通过调控EPCs的黏附、迁移、增殖以及血管形成能力，促进受损组织区域内微血管的新生，而在缺血性心肌组织损伤修复的进程中发挥着重要的作用。
本研究还分别从PKD1激活和阻断两个截然相反的角度证实PKD1可以明显上调EPCs中eNOS的mRNA和蛋白表达水平。eNOS和其产物NO在血管系统的稳态维持中扮演着重要的角色，不仅调控着血压水平、血管的紧张度，而且发挥着重要的抗炎、抗氧化、抗血栓形成效应[6]。eNOS的激活是通过1179的丝氨酸激活位点，Akt、CaMKII、AMPK、PKD1均可以通过这一位点而激活eNOS[7, 8]。之前的文献报道，在VEGF介导的eNOS激活的进程中，PKD1是必不可少的[9]。也有学者认为，eNOS属于新发现的PKD的底物，因为eNOS被各种氨基酸识别结合激活的位点恰恰均存在于现有报道的PKD底物之内，采用PKD1阻断剂或者基因沉默PKD1均可以以一种依赖eNOS的方式阻断动脉内皮细胞的迁移，减缓受损伤口的愈合[10]。和上述结果相似，我们的研究也表明，PKD1可能以一种依赖eNOS的方式促进EPCs的黏附、迁移、增殖和血管形成。
当前在缺血性心脏病的临床治疗进程中，由于心肌细胞分化和增殖能力极差，心肌组织缺血受损后通常以纤维组织进行疤痕修补，这对修复后的心脏功能产生较大的损害作用[11]。本研究结果对于后续的骨髓源性EPCs移植至心肌梗死大鼠动物模型或者心肌梗死患者受损的心肌组织中，促缺血区域局部血管的新生，以及干预PKD1诱导EPCs分化为内皮细胞，促内皮细胞迁移，减轻或者逆转损伤心肌组织纤维化修复进程，促损伤心肌组织心功能状态的恢复有积极的参考意义。
(致谢：本文的实验在南阳理工学院医学实验中心完成，实验由杨雷博士和毛秉豫教授共同设计，并进行经费资助。刘暖为实验的主要完成人，徐国昌主要负责统计学工作，叶松山、张培华、张瓅芳协助进行分子生物学实验。对以上同志的工作特别表示感谢！)
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