2. 广西中医药大学第一附属医院, 广西 南宁 530023
2. the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, China
衰老是使生物体发育到成熟期以后，随着年龄的增长，在形态结构和生理功能方面出现的一系列退行性变化[1]。随着社会逐渐步入老龄化，深入研究人类衰老理论，为人类延缓衰老提供理论依据，已成为医学界普遍关注的热点。天然药物具有多成分多靶点特征，有可能在抗阿尔茨海默病(AD)中发挥重要作用。天胡荽为伞形科植物天胡荽( Hydrocotyle sibthorpioides Lam)的全草，别名满天星、破铜钱、落得打等，是一种多年生草本植物，广泛分布于中国大陆及台湾的部分地区，具有清热解毒、化痰止咳、利尿消肿的作用，常用于治疗湿热黄疽、咳嗽、百日咳、咽喉肿痛、目赤云黯、淋病、湿疹、带状疤疹、疮疡肿毒等症[2]。有报道[3],积雪草苷类衍生物能抑制Aβ诱导的海马运动神经元凋亡，可明显改善轻、中度老年性痴呆的认知功能，羟基积雪草苷为积雪草提取物主要活性成分之一，对慢性中毒性痴呆小鼠有治疗作用。本实验将对羟基积雪草苷进行药效学研究，探讨其对D-半乳糖致亚急性衰老模型小鼠学习记忆功能的影响，初步分析羟基积雪草苷改善学习记忆的作用机制。
Morris水迷宫(中国科学院药研所)；7500Fast型荧光定量PCR仪(Applied Biosystem公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；手持式高速匀浆机(宁波新芝生物科技股份公司)；低温高速离心机(美国Thermo Fisher公司)；中压制备液相色谱仪(瑞士Buchi公司)。
天胡荽购于广西南宁千金子中草药有限公司;D-半乳糖购于华美生物工程有限公司; 蛋白浓度测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；Western blot抗体试剂盒购自美国Abcam公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。
1.3 动物昆明SPF级小鼠，♂，体质量(30±2) g，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(桂)2014-0002。
2 方法 2.1 天胡荽羟基积雪草苷的分离采用乙醇回流，石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次萃取，AB-8大孔吸附树脂纯化，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20和制备型HPLC纯化得到一白色单体，其化学结构鉴定数据：mp 217-219℃; IR (KBr,ν·cm-1) δ: 3423,1733,1379; ESI-MS m/z: 975 [M+Na]+;1H-NMR(300MHz,DMSO-d6) δ: 1.88,1.81,1.79,1.19,0.95,1.77,1.02,5.91,5.04,4.62;13C-NMR (CDCl3,100 MHz) δ: 50.7 (C-1),75.4 (C-2),78.5 (C-3),43.4 (C-4),48.8 (C-5),67.8 (C-6),41.5 (C-7),44.8 (C-8),48.9 (C-9),39.1 (C-10),24.3 (C-11),126.6 (C-12),138.1 (C-13),39.8 (C-14),28.9 (C-15),25.0 (C-16),48.6 (C-17),53.5 (C-18),39.6 (C-19),39.3 (C-20),31.1 (C-21),37.1 (C-22),66.9 (C-23),16.2 (C-24),19.5 (C-25),19.2 (C-26),23.9 (C-27),176.6 (C-28),17.5 (C-29),21.4 (C-30),95.8 (C-1′),73.9 (C-2′),78.0 (C-3′),71.2 (C-4′),78.6 (C-5′),69.8 (C-6′),105.1 (C-1″),74.2 (C-2″),77.4 (C-3″),78.6 (C-4″),76.6 (C-5″),61.6 (C-6″),102.8 (C-1'''),70.6 (C-2'''),72.6 (C-3'''),72.9 (C-4'''),69.3 (C-5'''),18.8 (C-6''')。经文献检索确定该化合物为羟基积雪草苷，与相关文献报道一致[4]。
2.2 动物造模与给药将小鼠随机分为5组，即正常组、模型组、MHS治疗组(低、中、高剂量)。模型组和MHS治疗组小鼠皮下注射D-半乳糖150 mg·kg-1，同时，MHS低、中、高剂量组分别灌胃MHS 5、10、20 mg·kg-1，正常组小鼠给予等量生理盐水，每日1次，连续12周。
2.3 Morris水迷宫实验Morris水迷宫分为4个象限，把直径为6 cm的黑色平台置于第三象限中央，水池上方安装摄像头并连接计算机，自动采集动物游泳轨迹图像并自动分析和处理，记录小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)。各组小鼠每天连续进行4次实验，每次入水点不同，小鼠找到平台后，在平台上休息10 s后进行下一次训练，记录60 s内小鼠找到平台的时间。若小鼠在60 s内未找到平台，则将其引至平台停留10 s，逃避潜伏期记为60 s，实验持续6 d时间。
2.4 Western blot法测定小鼠海马组织中Aβ1-42蛋白、可塑性相关蛋白的表达取约100 mg组织，剪碎，加入50 μg蛋白裂解液，冰上匀浆，采用8％的SDS-PAGE分离凝胶电泳，转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭，分别与一抗Aβ1-42、PSD-95、p-NMDAR1、p-CaMKII、p-PKACβ、PKCγ、p-CREB、BDNF抗体反应，4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液洗涤3次，室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1.5 h，磷酸盐缓冲液洗涤3次，抗原-抗体染色，二氨基联苯胺显色。将切片用蒸馏水洗涤，脱水，扫描，条带凝胶成像分析仪采集后，以β-actin作为内参，进行定量分析。结果以目的条带和内参照的光密度百分比表示。
2.5 RT-PCR检测小鼠海马组织中Aβ相关基因表达 2.5.1 引物设计与合成根据APP、BACE1、CatB、NEP、IDE和GAPDH基因全序列，由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司设计并合成引物，引物序列见Tab 1。
| Gene | Sense primer | Anti-sense primer |
| BACE1 | 5′-AGGGCTTGCACCTGTAGGAC-3′ | 5′-GCCTGAGTATGACGCCAGTA-3′ |
| CatB | 5′-ACAAGCCTTCCTTCCACCCG-3′ | 5′-TGTCCTCACCGAACGCAACC-3′ |
| NEP | 5′-TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ | 5′-CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3′ |
| IDE | 5′-TGGTCATCTAATTGGGCACG-3′ | 5′-AACCTCGGGCTCCTTCCTTC-3′ |
| GAPDH | 5′-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3′ | 5′-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3′ |
采用试剂盒法从小鼠海马组织提取总RNA，紫外分光光度计检测260 nm及280 nm处的吸光度比值，用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳监测总RNA的完整性。用逆转录试剂盒法进行RNA逆转录，合成cDNA，保存于-20 ℃，待用。
2.5.3 PCR扩增及扩增产物检测PCR扩增反应条件如下：95 ℃预变性120 s，95 ℃变性15 s，58 ℃(GAPDH、APP、BACE1和CATB)和60 ℃(GAPDH、NEP和IDE)退火30 s，72 ℃延伸45 s，后三步循环40次。以AB7500 Fast型荧光定量PCR系统SDS软件版本2.0.5，采用2-△△Ct法进行相对定量分析。
2.6 统计学处理数据以x±s表示，使用SPSS 11.5软件对实验数据进行分析，不同实验组间比较采用单因素方差分析。
3 结果 3.1 Morris水迷宫实验结果比较Morris水迷宫实验中，与正常组比较，模型组小鼠到达平台潜伏期明显增加( P ＜ 0.05)，经10、20 mg·kg-1 MHS治疗后小鼠逃避潜伏期明显降低( P ＜ 0.05)，提示MHS能改善小鼠认知功能障碍，提高小鼠学习记忆能力，见Tab 2。
| (x±s, n =15) | ||||||
| Group | Escape latent period/s | |||||
| 1 d | 2 d | 3 d | 4 d | 5 d | 6 d | |
| * P ＜ 0.05 vs D-gal model control. | ||||||
| Normal | 33.6±2.3* | 25.8±1.9* | 20.3±1.5* | 15.4±1.1* | 13.2±0.9* | 10.7±0.8* |
| Model | 52.6±2.8 | 50.3±1.8 | 48.2±1.7 | 43.9±1.9 | 40.8±2.2 | 38.7±1.6 |
| MHS 5 mg·kg-1 | 51.6±2.3 | 47.3±2.1 | 43.9±1.6 | 40.5±1.4 | 37.5±2.2 | 35.6±1.7 |
| MHS 10 mg·kg-1 | 50.2±1.8 | 46.8±2.3 | 41.2±1.9* | 35.1±1.5* | 30.5±1.7* | 28.4±1.9* |
| MHS 20 mg·kg-1 | 47.5±2.2 | 43.8±1.8 | 37.9±1.7* | 30.4±1.5* | 26.8±1.6* | 21.2±1.5* |
与正常组相比，模型组小鼠海马Aβ1-42蛋白的表达明显增高( P ＜ 0.05)，经10、20 mg·kg-1 MHS治疗后则明显降低( P ＜ 0.05)，提示MHS能减轻Aβ1-42产生的神经毒性，缓解认知功能障碍，见Tab 3，Fig 1。
| (x ±s , n =15) | |
| Group | Aβ1-42 protein/β-actin in hippocampus |
| * P ＜ 0.05 vs D-gal model control. | |
| Normal | 0.36±0.03* |
| Model | 0.97±0.07 |
| MHS 5 mg·kg-1 | 0.92±0.08 |
| MHS 10 mg·kg-1 | 0.69±0.05* |
| MHS 20 mg·kg-1 | 0.53±0.04* |
|
| Fig 1 Effects of madecassoside on Aβ1-42 protein in hippocampus |
与正常组相比，模型组小鼠APP、BACE1、CatB含量明显增高而NEP、 IDE含量则明显下降( P ＜ 0.05)，经10、20 mg·kg-1 MHS治疗后APP、BACE1、CatB的表达明显降低，NEP、IDE表达则明显增高( P ＜ 0.05)，提示MHS能平衡β-分泌酶及Aβ降解酶，减轻Aβ的过度沉积与聚集，减轻认知功能障碍，见Tab 4。
| (x ±s , n =15) | |||||
| Group | APP | BACE1 | CatB | NEP | IDE |
| * P ＜ 0.05 vs D-gal model control. | |||||
| Normal | 0.47±0.06* | 0.25±0.02* | 0.30±0.03* | 0.86±0.06* | 0.79±0.06* |
| Model | 0.89±0.07 | 0.73±0.04 | 0.82±0.06 | 0.42±0.03 | 0.41±0.05 |
| MHS 5 mg·kg-1 | 0.86±0.06 | 0.72±0.05 | 0.81±0.06 | 0.44±0.04 | 0.43±0.06 |
| MHS 10 mg·kg-1 | 0.68±0.06* | 0.51±0.03* | 0.50±0.04* | 0.73±0.05* | 0.68±0.05* |
| MHS 20 mg·kg-1 | 0.56±0.05* | 0.39±0.04* | 0.37±0.04* | 0.78±0.04* | 0.75±0.07* |
与正常组相比，模型组小鼠突触可塑性相关蛋白PSD-95、p-NMDAR1、p-CaMKII、p-PKACβ、PKCγ、p-CREB、BDNF 明显下降( P ＜ 0.05)，经10、20 mg·kg-1 MHS治疗则后明显增高( P ＜ 0.05)，提示MHS能保护突触可塑性的完整性，减轻认知功能障碍，见Tab 5，Fig 2。
| (x ±s , n =15) | |||||||
| Group | PSD-95 | p-NMDAR1 | p-CaMKII | p-PKACβ | PKCγ | p-CREB | BDNF |
| * P ＜ 0.05 vs D-gal model control. | |||||||
| Normal | 1.10±0.07* | 0.70±0.05* | 1.17±0.06* | 1.11±0.07* | 0.64±0.06* | 1.02±0.07* | 0.68±0.06* |
| Model | 0.55±0.04 | 0.36±.04 | 0.46±0.03 | 0.41±0.03 | 0.24±0.02 | 0.38±0.03 | 0.29±0.03 |
| MHS 5 mg·kg-1 | 0.87±0.05 | 0.57±0.04 | 0.89±0.07 | 0.93±0.06 | 0.44±0.03 | 0.62±0.05 | 0.45±0.03 |
| MHS 10 mg·kg-1 | 1.03±0.07* | 0.61±0.05* | 1.02±0.07* | 1.17±0.08* | 0.68±0.05* | 0.94±0.07* | 0.52±0.03* |
| MHS 20 mg·kg-1 | 1.21±0.08* | 0.63±0.05* | 1.12±0.06* | 1.23±0.08* | 0.71±0.04* | 0.97±0.06* | 0.87±0.07* |
|
| Fig 2 Effects of madecassoside on expression of genes related to Aβ in hippocampus ( x±s, n =15) A:Normalcontrol;B:Modelcontrol;C:MHS;5mg·kg-1;D: MHS10mg·kg-1;E:MHS20mg·kg-1 |
学习记忆是大脑的高级神经生理活动，因此检测药物干预后模型动物的学习记忆能力是判断药物疗效的重要指标之一[5]。本实验采用D-半乳糖诱导小鼠亚急性衰老模型，并采用水迷宫对小鼠进行行为学测试，实验结果显示，给予D-半乳糖12周后，小鼠出现较严重的认知功能障碍，逃避潜伏期明显增高，学习记忆能力明显下降。MHS同步干预12周后，各剂量MHS不同程度地降低小鼠逃避潜伏期，说明MHS对D-半乳糖致亚急性衰老模型小鼠的学习记忆有改善作用。
β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)是中枢神经系统退行性疾病形成过程中的核心因子，在认知功能障碍等衰老现象发生和发展中起着重要的作用。Aβ1-42寡聚体具有神经毒性，直接导致突触功能紊乱，是造成神经变性的重要原因之一。我们的实验发现，与正常组相比，模型组小鼠Aβ1-42蛋白表达明显升高，提示具有更高的神经毒性。各剂量MHS干预后可明显抑制小鼠海马Aβ1-42蛋白的表达，从而降低神经毒性，进而改善小鼠认知功能障碍。研究结果提示，MHS改善学习记忆功能可能与抑制Aβ表达，减轻神经毒性有关。
Aβ由淀粉样前体蛋白(APP)经β-分泌酶、γ-分泌酶裂解产生，正常情况下，Aβ保持产生与降解的平衡状态。病理条件下，Aβ产生、聚集过多，引起神经炎性改变，突触缺失，导致认知功能障碍。因此，减少Aβ生成或促进Aβ降解，便可有效地延缓认知功能障碍等衰老现象。β位淀粉样前体蛋白裂解酶-1(BACE1)和组织蛋白酶B(cathepsin B,CatB)是最主要的β-分泌酶，参与水解APP产生Aβ。病理条件下，外显子剪切方式改变、miRNA半衰期缩短等可导致BACE1表达增多，转录及转录后水平、翻译及翻译后修饰这一平衡被打破等可导致CatB表达增高，通过抑制BACE1及CatB表达可减少淀粉样沉积，缓解认知障碍。有研究表明[6]，脑啡肽酶(NEP)、胰岛素降解酶(IDE)是重要的Aβ降解酶，NEP的催化位点暴露在细胞外，是脑中细胞外不溶性Aβ的主要降解酶，IDE位于神经元细胞膜上，主要参与细胞内可溶性Aβ单体的降解。最近发现[7]，NEP启动子GT重复序列多态性可能影响NEP转录活性，或改变NEP分子构型而降低酶活性，IDE是一种在中性条件下发挥作用的酶，降低pH值可明显降低酶活性，在认知功能障碍时脑内pH偏低，这可能是该酶活性降低的原因。实验结果发现，与正常组相比，模型组小鼠APP、BACE1、CatB表达较高，而NEP、IDE表达则下降，通过促进Aβ生成及抑制Aβ降解而使其表达增强。各剂量MHS可明显抑制APP、BACE1、CatB基因的表达，减少淀粉样沉积，提高NEP、IDE基因的表达水平而增强Aβ降解，从而缓解认知障碍。研究结果提示，MHS通过调节与Aβ生成和降解相关的酶来降低Aβ的含量，缓解认知障碍。
突触可塑性(synaptic plasticity) 指神经元之间突触性连接的变化，包括突触效能的增强或减弱、受体蛋白分布、突触后信号转导机制的改变和神经元间突触分布的数量变化[8]。突触可塑性是学习记忆的细胞分子学基础，其介导了神经兴奋性的传导，对神经元突触可塑性和神经构筑产生了重要影响，因而与学习记忆关系密切。学习记忆的实质是信号转导和处理的过程，而一切功能的产生都是以某种特定的结构形式为基础，有报道称突触可塑性正是学习记忆的机制[9]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养索家族的成员之一，它不仅对神经元的生存、生长、分化有重要的影响，而且还能增强突触联系，影响神经元的可塑性，并且与学习记忆有关[10]。BDNF在参与学习记忆过程中，如Morris水迷宫，海马中BDNF mRNA的表达明显升高，提示BDNF的基因转录与学习记忆过程密切相关。相关研究证实[11],cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)是学习记忆中的一个关键因子，参与海马的空间记忆学习。CREB是依赖cAMP的转录因子，受细胞内多条通路的调节，只有当Ser133被蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)或钙调蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKII)等磷酸化(即pCREB)后就成为活性状态，在空间记忆的形成中有重要作用[12] 。有证据表明PKC和PKA信号通路，尤其是那些同工酶PKACβ和PKCγ，在学习记忆过程中起着重要作用[13]。NMDA受体是目前已知的最重要的突触强度长时程修饰作用“触发器”，在学习记忆形成中的关键作用已经证实[9]。突触前神经元释放谷氨酸，与NMDAR结合后，将突触前电信号转化为突触后神经元内Ca2+信号，启动一系列生物化学反应，引起突触的可塑性变化[14] 。Morris水迷宫成绩与NMDAR1荧光密度正相关，学习记忆损伤时，海马神经元的NMDAR1亚基明显降低。CaMKII通过其自身磷酸化，被认为代表从短期到长期信息存储的“分子开关”的过渡[15]，可认为是神经元信息存储相关过程的关键分子。突触后致密物(postsynaptic density 95,PSD-95)是树突棘的主要成分，在突触后密集区含量丰富，在突触可塑性中起重要作用，其增厚可诱导LTP形成。实验结果发现，与正常组相比，模型组小鼠PSD-95、P-NMDAR1、P-CaMKⅡ、P-PKACβ、PKCγ、P-CREB、BDNF等突触可塑性相关蛋白含量表达下降，突触可塑性受损，认知功能出现障碍。各剂量MHS可明显增强上述突触可塑性相关蛋白表达，保护小鼠突触的完整性，进而缓解认知功能障碍，改善小鼠学习记忆功能。研究结果提示，MHS对抗认知功能、提高学习记忆在一定程度上与其保护海马突触的完整性有关。
我们的研究表明，MHS可明显改善D-半乳糖引起的小鼠学习记忆功能损伤，其机制可能与抑制Aβ生成与沉积及增强突触可塑性相关蛋白表达有关。
(致谢：本实验在广西医科大学医学科学实验中心及药学院实验中心完成，感谢林兴教授、黄权芳副主任药师及韦玲同学的指导及帮助。)
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