头孢克肟(cefixime，CE)是常用消炎药，目前未见用光谱法研究CE与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的报道，以往研究药物与BSA相互作用主要集中在猝灭机制探讨上，而本文在优化实验条件的情况下从更多方面系统地研究了CE与BSA的结合反应，除了常规的作用机制的研究，还深入探讨了3个不同温度下两者的结合位点、结合力类型、结合部位、药物协同作用以及对BSA构象的影响等。这些研究对于阐明CE在机体内的传输、代谢过程及药理作用具有有益的参考意义。

F-4600荧光光谱仪(日本日立公司)，测定参数：狭缝宽度10.0 nm，光电倍增管负高压为400 V；Cary50型紫外可见光谱仪(美国瓦里安技术中国有限公司);pHS-3C精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司);超级恒温水浴(DHG-9035A型，上海一恒科技有限公司)。牛血清白蛋白(BSA，上海楷样生物技术有限公司);头孢克肟(97%，百灵威科技有限公司);其它试剂均为分析纯，经检测在测量波段均无荧光杂质，实验用水为超纯水。

于10 mL的比色管中依次加入1.0×10^-5 mol·L^-1的BSA 1.0 mL和不同体积的9.854×10^-5 mol·L^-1的头孢克肟溶液，0.5 mol·L^-1 NaCl溶液2.0mL(为维持体系的离子强度)和0.1 mol·L^-1，pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液1 mL用水稀释至刻度并摇匀，放置25 min。分别在291K、301K、311K温度下，扫描荧光猝灭光谱和同步荧光光谱(Δλ=15 nm和60 nm)，记录F₀和F(F和F₀分别指CE存在与不存在时BSA的荧光强度)。其最大激发波长(λex)和最大发射波长(λem)位于280 nm/340nm 处。以相应的CE溶液作为参比，记录CE-BSA体系的吸收光谱。

分别考察了缓冲溶液种类、用量、pH值、BSA的浓度、试剂加入顺序和反应时间对体系荧光强度的影响。结果表明，选用0.01 mol·L^-1，pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液1.0 mL维持体系酸碱度，1.0×10^-6 mol·L^-1 BSA作为反应浓度，BSA→CE→NaCl→Tris-HCl的加入顺序，放置25 min后进行测量时效果最佳。

在实验条件下，CE在测量波段没有荧光，而BSA的荧光较强，并在λex/λem=280/340nm处，当CE加入到BSA之后，虽然λex/λem几乎未发生变化，但是其荧光强度明显随着CE浓度的增加而逐渐减弱，表明CE能猝灭BSA的荧光，CE与BSA之间存在着相互作用。

猝灭过程遵循S-V方程：F₀/F=1+K_sv[C]=1+K_qτ₀[C] ，式中K_sv为猝灭常数；K_q为速率常数(动态猝灭时最大值约为2×10¹⁰L·mol^-1·s^-1)^{[1, 2]}；τ₀为荧光体平均寿命，一般为10^-8 s数量级^{[1 ,2]}；[C]为CE浓度。按照实验方法在291K、301K、311K时以F₀/F对[C]作图。根据K_q=Ksv/τ₀可求出不同温度下的K_q值，结果列于Tab1中。表中K_q值比动态猝灭最大速率常数大两个数量级，说明CE对BSA的猝灭不属于动态猝灭。随着温度升高，直线斜率即Ksv减小，正好与静态猝灭机制相吻合。

若CE对BSA为静态猝灭，应符合L-B方程^{[1, 2]}： (F₀-F)^-1=F₀^-1+(K_LBF₀[C])^-1，式中K_LB为静态猝灭结合常数。(F₀-F)^-1-[C]^-1作不同温度下的L-B曲线，计算K_LB值列于Tab1中，表中3个温度下的K_LB值都在10³数量级以上，表明CE与BSA由于发生静态猝灭而结合力较强。随着温度的升高，K_LB也逐渐下降，这与因静态猝灭方式而形成的复合物随温度升高，而越不稳定的作用机制正好相符合。

紫外吸收光谱也是一种区分猝灭机制的重要方法^{[1, 2]}，实验表明，CE的加入使BSA中苯环上的π-π^*跃迁引起的特征吸收峰从278 nm红移到290 nm，吸收强度也随CE浓度的加大而明显增加。CE的加入引起BSA紫外吸收光谱的变化这一现象，说明CE与BSA间发生反应，有新物质生成，更进一步证明两者之间的相互作用机制属于静态猝灭机制。

如药物小分子与BSA大分子存在n个等同且独立的结合位点，它们相互作用的关系符合lg[(F₀-F)/F]= lgK_b+nlg[C] 公式^{[1, 2]}。分别在291K、301K、311K温度下，以lg(F₀-F)/F对lg[C]作图，由直线的斜率和截距可求出CE与BSA不同温度下的结合常数K_b及结合位点数n，见Tab1。由Tab1可知，K_b和n都随温度增加而降低，这与因复合物稳定性随温度增加而下降的静态猝灭机制是十分吻合的。3个温度下的n都约等于1，表明CE与BSA结合后可形成一个结合位点。温度每升高10K，K_b值减小的程度很小，表明两者结合作用对温度变化不敏感。总之，温度的提升不利于血清白蛋白携带着CE在体内进行运转、贮存和分配。

根据热力学公式^[3]，计算291K、301K、311K温度下CE与BSA结合反应的ΔH，熵变ΔS 及吉布斯自由能变ΔG，结果见Tab2。根据Ross等^[3]总结出的的规则判断，由Tab2可得，ΔG < 0，表明BSA与CE的反应能自发进行；Δ H< 0，表明反应为放热反应；ΔS>0，表明其过程是熵增加的自发过程；Δ H< 0，且ΔS>0，表明静电作用力是CE与BSA的主要结合作用力。

大多数药物在BSA上结合部位为亚螺旋域ⅡA(含有酪氨酸和色氨酸)和亚螺旋域ⅢA(含有酪氨酸)^{[4 ,5]}。在波长280 nm和295 nm激发下，CE对BSA的猝灭程度曲线是分开独立的，没有交叉和重叠，说明色氨酸和酪氨酸残基都参与其中，对比这两种波长下的荧光猝灭程度可知，在280 nm激发时降低程度更大些，这一现象说明在CE与BSA的结合过程中，结合位点主要位于亚螺旋域ⅡA。

BSA具有多重结合部位，药物与BSA结合时，BSA各结合部位之间存在相互影响作用，这种相互影响作用称为药物的协同作用^{[4, 5]}，可用Hill方程^{[4, 5]}进行分析，CE-BSA的n_H值的计算结果见Tab2。Tab2表明，3个温度下的n_H都小于1，表现为负协同作用^{[4, 5]}，说明CE与BSA结合过程中，随着配体CE不断地结合到位点，使得后继配体对BSA的亲和性减弱，即前一个药物分子结合到BSA位点上后，对后一个药物分子与BSA的结合起到阻碍作用。随着温度的变化，虽然n_H变化不大，但也随温度升高而增加，说明温度的提升对CE药物小分子之间的协同作用有利。

在Δλ=15 nm和Δλ=60nm条件下测CE加入BSA之后的同步荧光光谱，随CE浓度的增大，酪氨酸和色氨基酸残基的λ_max几乎没有发生移动，说明CE的加入不改变了BSA的构象^[2]。

用荧光和紫外光谱法推断CE对BSA荧光产生静态猝灭，CE和BSA之间的作用力类型主要为静电作用力。测得291K、301K、311K的K_b、n和n_H。CE与BSA可形成一个结合位点，表明CE可被BSA运输。n_H＜1，表明CE对结合反应产生负协同作用，即CE加入使BSA的亲和性减弱，不利于后续CE与BSA的结合。结合部位在BSA的亚螺旋域ⅡA中。同步荧光光谱表明CE几乎不对BSA构象产生影响。该研究结果为了解CE在体内的运输和代谢过程、毒性机制提供了重要信息。