2. 河北大学科学技术处, 河北 保定 071002
2. Science and Technology Office, Hebei University, Baoding Hebei 071002, China
随着工业发展、环境污染加重以及人们生活方式现代化，变态反应性疾病发病率呈逐年增加的趋势，已经成为一种常见病和流行病，尚未有肯定的治愈方法[1]。世界卫生组织(WHO)将变态反应性疾病列为21世纪重点研究和防治的三大疾病之一，已受到诸多研究者的广泛关注[2]。肥大细胞、嗜碱性粒细胞等效应细胞表面FcεRI与IgE结合是触发变态反应的关键，以IgE/FcεRI信号通路为靶点进行药物设计已成为当前治疗变态反应性疾病药物研究的热点[3, 4]。
大鼠嗜碱性白血病细胞(rat basophilic leukemia cells,RBL-2H3)是大鼠嗜碱粒细胞肿瘤株的一个亚系，细胞膜表达IgE高亲和力受体FcεRI，具有肥大细胞的多种生物学特性，是实验室中常用的一种早期、稳定且敏感的肥大细胞脱颗粒体外检测模型[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13]。由于人肥大细胞不易获得且培养条件要求严格，RBL-2H3细胞一直是研究变态反应发病机制及治疗方法的模式材料[6, 7, 8]。据文献报道，人IgE具有高度的种属特异性，人IgE仅与人FcεRI结合，而不与啮齿类动物体内FcεRI作用，因此，以RBL-2H3细胞为基础进行体外人IgE与FcεRI的作用研究及药物设计具有一定的局限性。本研究利用基因工程技术克隆hFcεRIα基因，通过构建pCI-neo-hFcεRIα真核表达载体，建立了稳定表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞。该重组细胞模型将为深入研究变态反应发病机制及药物开发提供条件基础。
1 材料与方法 1.1 材料RBL-2H3大鼠嗜碱性白血病细胞购自中国科学院细胞库；pCI-neo载体、DH5α菌株由本实验室保存；限制性内切酶Xba I、EcoR I、T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、RNA 提取试剂盒、兔抗人FcεRIα抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司；dNTD、PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、逆转录试剂盒、FITC标记羊抗兔IgG、HRP标记羊抗兔IgG购自康为世纪生物科技有限公司；DMEM培养基、胰蛋白酶、G418购自索来宝生物科技有限公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；GeneTran III转染试剂购自Biomiga；PCR引物等DNA均由生工生物工程有限公司合成。
1.2 人FcεRIα基因的克隆依据GenBank公布的hFcεRIα基因组序列及表达载体pCI-neo多克隆酶切位点设计引物序列如下：上游引物：5′- 
GAAGAAGATGGCTCCTGC-3′ (25 bp)，下划线部分表示EcoR I限制性内切酶识别位点；下游引物：5′- GC
TCAGTTGTTTTTGGGGT TTG-3′ (28 bp)，下划线部分表示Xba I限制性内切酶识别位点。U937细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培养液中，当细胞汇合度达90%时提取细胞总RNA，RT-PCR法克隆hFcεRIα基因，按以下反应程序扩增目的基因：cDNA 1 μg；94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；25个循环；72 ℃，2 min。纯化回收目的片段。
取质粒载体pCI-neo和回收的hFcεRIα目的片段，分别用Xba I和EcoR I限制性内切酶于37 ℃双酶切1 h，然后酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化，再在T4连接酶的作用下于16 ℃连接过夜。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，涂于含有氨苄青霉素(50 mg·L-1)的LB固体培养基，置于37 ℃生化培养箱中培养12~16 h。挑取单克隆菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(50 mg·L-1)的LB液体培养基中，37 ℃震荡培养过夜。质粒试剂盒提取重组质粒，将Xba I和EcoR I双酶切鉴定正确的菌液送生工生物工程有限公司测序。将测序结果通过blast比对，完全正确的质粒命名为pCI-neo-hFcεRIα。无内毒素试剂盒大量提取质粒并定量备用。
1.4 pCI-neo-hFcεRIα转染RBL-2H3细胞及转染条件的优化 1.4.1 脂质体转染步骤RBL-2H3细胞，用含10%新生牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，用0.25%的胰酶消化细胞传代，每2 d换液，3～4 d传代1次，收集对数生长期的细胞进行实验。转染前1 d RBL-2H3细胞均匀铺于24孔板，2×105个每孔。细胞汇合度达90%~95%时，按Biomiga说明书分别转染pCI-neo-hFcεRIα和pCI-neo：分别将适量质粒DNA和脂质体加入无抗生素、无血清的DMEM培养液50 μL中混匀，静置5 min。然后将两溶液混匀，室温放置20 min。吸弃培养板中的培养液，PBS清洗2遍，加入无血清、无抗生素的培养液200 μL，培养箱中孵育20 min。将转染混合液逐滴加入培养板，轻轻混匀，置于培养箱中孵育。
1.4.2 细胞接种数目的优化转染前1 d分别接种不同数目的细胞于24孔板：2×105、1×105、5×104个每孔，每组重复3次。24 h后观察细胞汇合度，通过免疫荧光结合细胞计数法检测转染效率。
1.4.3 质粒与转染试剂比例的优化确定合适的培养条件及细胞接种数目后，按照说明书确定加入质粒的量分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg，质粒加入量与转染试剂量的比例依次设定为1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4进行转染。24 h后，免疫荧光结合细胞计数法计算细胞转染效率。
1.5 稳定转染细胞株的筛选RBL-2H3细胞培养于含10%新生牛血清的DMEM完全培养液中，均匀铺于24孔板，1 000个细胞每孔。待细胞汇合度达50%时，向每孔中加入G418至终浓度分别为：0、300、400、500、600、700、800、900 mg·L-1，每个浓度设3个复孔。培养2～3 d更换培养液，并保持G418浓度不变，培养10～14 d。选取RBL-2H3细胞全部死亡的最低G418浓度为最佳细胞筛选浓度。
细胞转染24 h后，按1 ∶ 10传代至含新鲜完全培养液的6孔板，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。24 h后用最佳细胞筛选浓度的G418进行筛选，每3 d更换含G418的培养液，至未转染组细胞全部死亡。采用有限稀释法将转染组细胞接种于96孔板，培养2～3 d后，观察细胞生长情况，标记生长有单克隆细胞的孔继续G418加压培养，停止板内生长多个克隆和无细胞生长的孔培养。3～4 d更换含G418的培养液，孔内单克隆密度达1/3时，消化细胞单克隆，逐级扩大培养至获得稳定的单克隆细胞系，同时以半G418浓度维持筛选。
1.6 hFcεRIα/RBL-2H3细胞的鉴定RT-PCR检测：利用试剂盒提取转染后细胞总RNA，RT-PCR法检测目的基因的表达。所用内参照为β-actin，上游引物为5′- CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′ (20 bp)，下游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′ (20 bp)，PCR产物应为308 bp。按以下反应程序进行扩增：cDNA 1 μg；94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；25个循环；72 ℃，2 min。反应结果进行琼脂糖凝胶电泳观察并拍照。
Western blot检测：转染24 h后，收集转染细胞，提取细胞膜蛋白，Western blot检测目的基因的表达。首先将膜蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上，4 ℃封闭过夜。再加与封闭液1 ∶ 500稀释的兔抗人FcεRIα抗体，37 ℃孵育1h，TBST洗2次，加入1 ∶ 2 000稀释后的HRP-标记的羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗2次，加入ECL发光液，检测结果并拍照。以β-actin作为内参。
免疫荧光检测：取转染细胞与野生型RBL-2H3细胞接种于24孔板，每毫升4×105个，培养箱中培养过夜。PBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗3次，5% BSA封闭1 h。与1 ∶ 500兔抗人FcεRIα多克隆抗体孵育过夜，PBS洗3次，再与FITC标记羊抗兔IgG孵育2 h，PBS洗3次后，荧光显微镜下观察并拍照。
2 结果 2.1 hFcεRIα基因的克隆提取U937细胞总RNA(Fig1A)，利用RT-PCR方法克隆得到了hFcεRIα基因(796 bp)(Fig1B)。测序后与GenBank: J03605.1提供序列相一致，表明成功克隆hFcεRIα基因。
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| Fig 1 Analysis of total RNA from U937 and product ofRT-PCR by agarose gel electrophoresis A: Total RNA; B: Product of RT-PCR(1: hFcεRIα gene; M: DM 2000). |
hFcεRIα重组质粒通过Xba I和EcoR I双酶切及PCR鉴定，电泳得到796 bp目的条带，与预期结果相符(Fig2)，表明成功构建pCI-neo-hFcεRIα表达载体。
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| Fig 2 Recombinant plasmid pCI-neo-hFcεRIα digested with Xba I and EcoR I M: DM 2000; 1: Product of recombinant plasmid digested with Xba I and EcoR I; 2: Product of PCR amplification of recombinant plasmid. |
分别接种细胞2×105、1×105、5×104个每孔于24孔板，含10%新生牛血清的无双抗培养液培养。24 h后显微镜下观察，发现每组汇合度依次为90%～100%、75%～85%、60%～70%；3组细胞按照说明书进行转染，结果发现细胞汇合度对转染效率影响较大，且汇合度达75%～85%时的细胞转染效率较佳，转染效率可达70.23%(Fig3)。
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| Fig 3 Effect of cell confluence on transfection efficiency |
接种细胞1×105个每孔，含10%新生牛血清的无双抗培养液培养，细胞汇合度达75%～85%时进行转染。分析发现当DNA加入量小于3.0 μg时，随着DNA加入量的增多，转染效率也随之增高；当DNA加入量大于3.0 μg时，随着DNA加入量的增多转染效率下降。当质粒加入量为3.0 μg、质粒与转染试剂比例为1 ∶ 3时转染效率最高，可达75.38%(Fig4)。
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| Fig 4 Effect of DNA and transfection reagenton transfection efficiency |
不同浓度的G418处理细胞，每隔2 d换1次液,且显微镜下观察细胞生长状况。开始时各组细胞均生长旺盛、状态良好；G418筛选3 d后，800、900 mg·L-1孔中部分细胞出现死亡，对照组细胞汇合度达90%；加压筛选6 d后，800、900 mg·L-1孔中细胞全部死亡，600、700 mg·L-1孔中部分细胞出现死亡，细胞状态差；加压筛选9 d后，700 mg·L-1孔中细胞全部死亡，600 mg·L-1孔中仅少数细胞贴壁存活；加压筛选12 d后，600 mg·L-1孔中细胞全部死亡，其余G418浓度孔内细胞仅部分死亡。因此，G418最佳筛选浓度为600 mg·L-1，见Fig5。将重组质粒转染细胞、空载质粒转染细胞及野生型RBL-2H3细胞用含有终浓度为600 mg·L-1 G418的培养液加压筛选，至野生型RBL-2H3细胞全部死亡而转染细胞克隆贴壁生长；改用含300 mg·L-1 G418的培养液维持筛选3～5代至转染细胞能稳定生长，继续传代并冷冻保存。
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| Fig 5 Conditions of RBL-2H3 cells treated with600 mg·L-1 G418 at different time A: Cells treated with no G418; B: 6 d; C: 9 d; D: 12 d. |
细胞转染24 h后，提取细胞总RNA，利用RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果如Fig6所示，转染pCI-neo-hFcεRIα的RBL-2H3细胞中hFcεRIα得到了表达，转染pCI-neo及未转染的RBL-2H3细胞中未检测到相应mRNA存在，内参β-actin在3种细胞内均正常表达。
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| Fig 6 6 hFcεRIα expressed in RBL-2H3 by RT-PCR analysis A1~3: β-actin expressed in RBL-2H3 transfected with pCI-neo-hFcεRIα, RBL-2H3 transfected with pCI-neo and RBL-2H3; M: DNA marker 2 000; 4~6: hFcεRIα expressed in RBL-2H3 transfected with pCI-neo-hFcεRIα, RBL-2H3 transfected with pCI-neo and native RBL-2H3. |
细胞转染24 h后，提取细胞膜蛋白，利用Western blot检测目的基因的表达。结果表明，转染pCI-neo-hFcεRIα的RBL-2H3细胞中hFcεRIα表达，而在转染pCI-neo及未转染的RBL-2H3细胞均无hFcεRIα表达(Fig7)。
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| Fig 7 Expression of hFcεRIα in RBL-2H3 by Western blot 1: RBL-2H3 cells with pCI-neo-hFcεRIα; 2: RBL-2H3 cells with pCI-neo; 3: Native RBL-2H3 cells. |
细胞转染24 h后，利用免疫荧光法检测目的基因的表达。结果表明，转染pCI-neo-hFcεRIα的RBL-2H3细胞中hFcεRIα蛋白免疫荧光鉴定结果呈阳性，荧光显微镜下可观察到绿色荧光(Fig8)，而转染pCI-neo及未转染的RBL-2H3细胞中hFcεRIα蛋白免疫荧光鉴定结果呈阴性，荧光显微镜下无绿色荧光。
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| Fig 8 Immunofluorescence assay of transfected RBL-2H3 cells A: Transfected cells with pCI-neo-hFcεRIα; B: Transfected cells with pCI-neo. |
肥大细胞是IgE介导的I型变态反应的主要效应细胞，RBL-2H3细胞系是大鼠嗜碱性粒细胞系的一个亚系，可以表达肥大细胞的许多特性和功能，常作为过敏反应性疾病体外 研究的替代模型。由于IgE与其高亲和受体FcεRI的作用具有种属特异性，故以RBL-2H3细胞为模型研究I型变态反应具有一定的局限性。因此，构建人源化的RBL-2H3细胞株是便于研究I型变态反应机制及治疗方法的重要手段之一。
肥大细胞表面IgE高亲和力受体FcεRI由4个亚基组成：1个α链、1个跨4次膜的β链及2个通过二硫键连接的γ链。研究者对此3种亚基在变态反应中的作用进行了大量研究，发现在人FcεRIα(hFcεRIα)转染的啮齿动物细胞中，当hFcεRIα与啮齿类FcεRI中γ共表达时，hFcεRIα的胞外区会高效表达[14, 15, 16]。本实验通过RT-PCR法得到人FcεRIα基因并将其克隆入真核表达载体pCI-neo，利用脂质体转染法将重组质粒导入RBL-2H3细胞，成功构建了hFcεRI/RBL-2H3细胞株，RT-PCR、Western blot以及免疫荧光结果均表明hFcεRIα在转染细胞内成功表达[17, 18, 19, 20]。
脂质体介导法是当前常用的转染方法，但不同细胞及不同载体的转染条件各不相同。本实验通过对转染条件进行优化，发现在转染过程中细胞生长状态及汇合度是影响转染效率的重要因素，待转染细胞处于对数期、汇合度达75%~85%时，转染效率最高可达70.23%。不同细胞的转染条件有很大的差异，卓长华等[21]在转染AAV-293细胞时发现,待细胞汇合度达60%~80%时细胞转染效率较佳；张欢等[22]选用汇合度达80%～90%的HEK293细胞进行转染；张椿等[23]则待H292细胞汇合度达90%～95%时进行转染。本研究采用Biomiga公司的GeneTran III high efficiency transfection reagent作为转染试剂，该产品推荐转染细胞的汇合度为90%~95%，在实验过程中发现按照此操作得到的结果不理想，分析原因可能是该细胞汇合度过高致细胞活性下降、细胞活力降低，从而导致该细胞转染效率降低，这一点可以进一步通过该细胞EB染色及MTT、CCK实验进行验证。此外，本实验优化了DNA和转染试剂的用量及比例，发现在一定范围内加大DNA及脂质体的用量会提高转染效率，分析认为细胞处于一定的汇合度时，DNA及脂质体相对不足；当脂质体过量时，其对细胞的毒性作用增大，从而导致转染效率降低。Karmali 等[24]亦有类似的研究。
细胞稳定转染最常用的筛选方法是G418筛选，在筛选前需要确定G418的最佳筛选浓度。众所周知，不同细胞对G418的敏感性不同，而同一细胞由于不同厂家、甚至同一厂家生产的相同浓度的G418的批次不同，其活性亦不尽相同，故即使是同一细胞，其最佳G418筛选浓度也有可能不同。Takagi等[17]建立稳定转染的RBL-2H3细胞株时使用500 mg·L-1的G418进行筛选；Taudou等[18]用含1 000～2 000 mg·L-1的选择性培养基筛选转染的RBL-2H3细胞；Zhang等[25]则在研究RBL-2H3细胞内Syt2的表达及作用时选用终浓度为800 mg·L-1的G418筛选稳定转染的RBL-2H3细胞。本实验通过对RBL-2H3细胞的最佳筛选浓度进行摸索，最终确定600 mg·L-1的G418为最佳筛选浓度。
综上所述，本实验成功构建了真核表达载体pCI-neo-hFcεRIα，建立了最佳RBL-2H3细胞转染及筛选体系，获得了稳定表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株，为基于RBL-2H3细胞模型研究变态反应奠定了基础。
(致谢:本研究于河北大学药学院药物质量分析控制重点实验室完成。)
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