2. 贵阳医学院药学院, 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心, 贵州 贵阳 550004;
3. 贵阳医学院药学院, 贵州 贵阳 550004
2. School of Pharmacy, Guiyang Medical College, Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and TCM, Ministry of Education, Guiyang 550004, China;
3. School of Pharmacy, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China
头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Ham. ex D. Don)。头花蓼又名石莽草、四季红、红酸杆等,属于蓼科(Polygonaceae),蓼属(Polygonum),头状蓼组(Cephalophilon)多年生草本植物,是少数民族地区的常用药。主要用于清热解毒、利尿通淋、肾盂肾炎、尿路结石、膀胱炎、痢疾、风湿痛、跌打损伤、尿道感染、疮疡湿疹等症[1]。目前开发出以头花蓼为主要原料的有“热淋清胶囊”、“热淋清颗粒”、“四季草颗粒”和“泌淋胶囊”等制剂。这些制剂广泛用于治疗泌尿道系统疾病,但是药品说明书中均未提及药物相互作用的相关信息。
细胞色素P450(CYP450) 超基因家族是人类药物代谢酶系统中最重要的一种酶,CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4是其重要的亚型[2],普遍认为90%的药物代谢是由CYP酶系介导的。CYP450酶系被抑制或被诱导是导致药物代谢性相互作用的主要原因,其中酶抑制作用所致药物相互作用的临床意义远大于酶诱导作用,约占代谢性相互作用的70%[3]。
基于头花蓼水提取物对CYP450的抑制和诱导作用研究未见相关报道,本课题以头花蓼水提取物(头花蓼相关制剂均为水提取物)为研究对象,采用人肝微粒体研究头花蓼水提取物对人肝微粒体细胞色素P450酶5种亚型的体外抑制作用,采用ICR小鼠研究头花蓼水提取物对小鼠细胞色素P450酶5种亚型的诱导作用,以探讨头花蓼相关制剂对CYP450酶亚型的调控作用,及推测与常用药物联用时是否产生药物相互作用,对促进临床合理用药并最大限度地避免盲目联合用药导致不良后果,保证临床用药的安全性和有效性具有重要意义。
1 材料 1.1 仪器超高效液相色谱系统(ACQUITY UPLC,美国沃特世公司,包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、电喷雾三重四级质谱仪、Masslynx 4.1质谱工作站);Allegra 64R低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司);AE240十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司);DK-98ПA恒温水浴锅(泰斯特);GILSON移液器(四川吉尔森仪器有限责任公司);700系列超低温冰箱(美国Thermo公司);PHS-3C型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。
1.2 试剂人肝微粒体(购于美国BD公司);NADP+(购于Roche公司);6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(购于Sigma公司);氯化镁、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾均为分析纯;甲醇为色谱纯;屈臣氏蒸馏水;乙腈为德国默克试剂公司。
1.3 药品与药材非那西丁(批号81105)、奥美拉唑(批号90925)、甲苯磺丁脲(批号20321);咪达唑仑注射液(批号20120903)江苏恩华药业股份有限公司;氯唑沙宗(批号100364-200301)、对乙酰氨基酚(批号100018-200408)购于中国食品药品检定研究院;羟基甲苯磺丁脲(批号1-PSB-27-2)、5羟基奥美拉唑(批号1-PSB-27-2)和6羟基氯唑沙宗(批号6-QFY-28-2)均购于加拿大TRC公司;α-羟基咪达唑仑(批号FN101512-07)购于美国Cerilliant公司;头花蓼药材采自贵州施秉的头花蓼GAP药材基地。
2 方法 2.1 头花蓼水提取物的制备和主要成分的含量头花蓼干燥全草,去除泥沙后,剪成小段,准确称量为2.67 kg,取10倍体积蒸馏水,浸泡30 min,煎煮2 h后过滤,再以8倍体积蒸馏水煎煮2 h,合并煎煮液浓缩,微波真空干燥,粉碎后准确称量,得棕色提取物固态粉末475 g。结果测定其水萃取产率17.79 %。
用UPLC-MS/MS法[4]测定本次提取的头花蓼水提取物中各成分的含量(n=6):没食子酸(14.41±0.95)‰(R.S.D. =6.57 %),原儿茶酸(0.43±0.03)‰(R.S.D. =5.92 %),杨梅苷(0.25±0.02)‰(R.S.D. =8.26 %),陆地棉苷(0.56±0.03)‰(R.S.D. =4.54 %),槲皮苷(2.11±0.15) ‰(R.S.D. =7.22 %),槲皮素-3-O-a-L-鼠李糖苷(0.46±0.03) ‰(R.S.D. =5.38 %),槲皮素(1.10±0.05) ‰(R.S.D. =4.56 %)。
2.2 动物实验ICR小鼠,♂,体质量18~20 g,清洁级,由重庆腾鑫生物技术有限公司提供,动物质量合格证:医动字第 SCXK (渝)2012-0008号。饲养及管理均严格按照实验室动物的要求及规则,在温度为(22±2)℃,湿度为(50±10)%的空调间饲养。
2.3 小鼠肝微粒体制备小鼠禁食过夜(自由饮水),颈椎脱臼后,剖腹,暴露肝脏,立即以4 ℃生理盐水洗去肝脏中血液,取出肝脏,按钙沉淀法[5]制备肝微粒体,置-80 ℃保存备用,采用考马斯亮蓝试剂盒测定肝微粒体蛋白浓度[6]。
2.4 分析条件 2.4.1 液相条件色谱柱:Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)柱,保护柱:Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm,1.7 μm),流速:0.35 mL·min-1,柱温:45 ℃,流动相:0.1 %甲酸乙腈(A)-0.1 %甲酸水溶液(B),检测5种专一性代谢产物的梯度条件 0~3.0 min 5 %~65 % A,3.0~3.5 min 65 %~90 % A,3.5~4.5 min 10 % A;进样体积 1 μL。
2.4.2 质谱条件电喷雾电离源(ESI);毛细管电压:3 kV;离子源温度:120 ℃;去溶剂气温度:350 ℃;去溶剂气:N2,流速650 L·h-1;反吹气:N2,流速:50 L·h-1;碰撞气:Ar,流速:0.16 mL·min-1;质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站,扫描方式为多反应离子监测模式(MRM);对乙酰氨基酚、6-羟基氯唑沙宗、羟基甲苯磺丁脲、α-羟基咪达唑仑、5-羟基奥美拉唑和葛根素(内标物)的离子对条件见Tab1。
Test drugs | ESI | Parent /m/z | Daughter /m/z | Cone /v | Collision /ev |
Acetaminophen | + | 152.0 | 110.0 | 30 | 15 |
6-Hydroxy chlorzoxazone | - | 183.8 | 120.0 | 30 | 20 |
Hydroxy tolbutamide | - | 285.0 | 186.0 | 35 | 18 |
α-Hydroxy midazolam | + | 342.0 | 324.0 | 35 | 20 |
5-Hydroxy omeprazole | + | 362.2 | 214.0 | 20 | 15 |
Puerarin (internal standard) | + | 417.0 | 267.0 | 40 | 30 |
采用NADPH再生系统,终体积为200 μL的体外孵育体系包含肝微粒体蛋白0.5 g·L-1、NADP+ 20 g·L-1、6-磷酸葡萄糖20 g·L-1、MgCl2 13.3 g·L-1、6-磷酸葡萄糖脱氢酶40 kU·L-1,甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、咪达唑仑、奥美拉唑和非那西丁在溶液中的浓度分别为100、50、25、50、50 μmol·L-1,以及不同浓度的头花蓼水提取物,其余为pH为7.4的0.1 mol·L-1 PBS缓冲溶液。37℃预孵3 min,加入各探针底物开始反应,孵育60 min,每次加入反应体系中有机试剂终浓度不超过1 % (V/V)。反应完毕后加入100 μL甲醇终止反应,再加入2 mg·L-1葛根素溶液100 μL,涡混,超声3 min,15 000 r·min-1离心10 min,生成相应的5种代谢物(羟基甲苯磺丁脲、6-羟基氯唑沙宗、α-羟基咪达唑仑、5-羟基奥美拉唑和对乙酰氨基酚)用UPLC-MS/MS定量分析。
2.5.2 头花蓼水提取物IC50值的测定将9个不同浓度的头花蓼水提取物(25、50、50、100、200、400、600、800、1 000 mg·L-1)分别与混合探针药物在人肝微粒体孵育液中共同孵化,对照组加入等体积的纯化水代替,每个样品平行操作3次,余下孵育处理程序同“2.5.1”项下,测定方法同“2.4”项下。使用GraphPad v5.0软件作图并计算IC50值。
2.5.3 体外头花蓼的剂量换算假设药物全部吸收经过肝脏代谢。正常成人肝脏重量为1.4 kg,每克肝脏组织可制得20 mg微粒体酶。孵育体系中药物浓度为C,总孵育体积为200 μL,微粒体酶浓度为0.5 g·L-1。那么每个健康肝脏制得微粒体酶量1.4×103×20 =2.8×104 (mg);
孵育体系中微粒体酶量=0.2×0.5 = 0.01(mg);
孵育体系中药物量=×一次给药剂量= 3.57×10-6×一次口服剂量(mg);
孵育体系中药物浓度C==1.785×10-5×一次口服剂量(g·L-1)。
临床上,头花蓼有关制剂一次口服剂量转化成生药量为10~20 g生药/次,根据水提取物的转化率17.79 %,10~20 g生药相当于提取物1.78~3.56 g,对应孵育体系中药物浓度C为31.77~63.54 mg·L-1。
2.6 头花蓼水提取物对小鼠肝微粒体CYP450酶的诱导作用研究ICR小鼠 (♂,18~20 g)30只,随机分成5组,每组6只。分为空白对照组(0.5% CMC-Na溶液灌胃)、0.58(7 d)、1.16(7 d)、0.58(14 d)和1.16 g·kg-1(14 d)药物处理组(分别给予 0.58 g·kg-1和 1.16 g·kg-1 头花蓼提取物的0.5% CMC-Na混悬液灌胃)。在d 8和d 15,以“2.3”法制备肝微粒体,小鼠肝微粒体的孵育同“2.5.1”项下,测定方法同“2.4”项下。
2.7 统计学处理实验数据以 ± s表示,抑制作用研究,使用GraphPad v5.0软件按照非线性回归,作图并计算IC50值;诱导作用研究,使用GraphPad v5.0软件中unpaired-t检验分析组间差异。
3 结果 3.1 头花蓼水提取物对CYP450酶的5个亚型活性的抑制作用结果表明,人肝微粒体中细胞色素P450酶5种亚型的体外抑制作用随头花蓼水提取物浓度的增大而逐渐减弱(Fig1),且使用GraphPad v5.0软件作图并计算孵育液中头花蓼水提取物对各个亚型的IC50值远大于31.77~63.54 mg·L-1,IC50值见Tab2,揭示头花蓼水提取物对5个亚型活性的抑制作用非常弱。
Probe drugs | CYP | IC50/mg·L-1 |
Tolbutamide | CYP2C9 | 1 780 |
Chlorzoxazone | CYP2E1 | 2 053 |
Midazolam | CYP3A4(M) | 2 214 |
Testosterone | CYP3A4(G) | 2 030 |
Omeprazole | CYP2C19 | 2 287 |
Acetaminophen | CYP1A2 | 849.6 |
以空白对照组酶活性均值为100%,1.16 g·kg-1 7 d组小鼠CYP2C9和CYP3A4活性分别增加了49.9 %和21.1 %(P < 0.01和P < 0.05),0.58 g·kg-1 14 d组小鼠CYP2C9和CYP3A4活性分别增加了27.6 %和15.5 %(P < 0.01和P < 0.05),1.16 g·kg-1 14 d组小鼠CYP2C9和CYP3A4活性分别增加了67.5 %和32.1 %(P < 0.01),头花蓼提取物对其余CYP亚型活性未见明显影响(Fig2)。
4 讨论本实验使用UPLC-MS/MS建立了同时测定人和小鼠肝微粒体孵育系统中Cocktail混合探针药物对应代谢物(CYP1A2-非那西丁/乙酰氨基酚、CYP2E1-氯唑沙宗/6羟基氯唑沙宗、CYP2C19-奥美拉唑/5-羟基奥美拉唑、CYP2C9-甲苯磺丁脲/羟基甲苯磺丁脲和CYP3A4-咪达唑仑/α-羟基咪达唑仑)的方法,此方法可特异、快速、准确、灵敏地同时测定孵育体系中的5个代谢物。
实验中采用人混合肝微粒体作为研究对象,可降低个体和种属差异造成的影响,具有实际指导意义。5种亚型酶的特异性抑制剂磺胺苯吡唑、氯美噻唑、酮康唑、氟康唑、ɑ-萘黄酮均能抑制人肝微粒体中CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4的活性,并且其IC50值在文献报道值的3倍以内,说明所建立的“Cocktail探针药物法”方法成功。而头花蓼水提取物对这5个亚型酶的IC50值为849.6~2 287 mg·L-1,远大于临床常用剂量31.77~63.54 mg·L-1,说明头花蓼对人肝微粒体中5个亚型酶没有抑制作用。文献报道,小鼠是模拟人肝脏CYP450代谢外源性物质最合适的动物模型。因此,本实验采用小鼠研究头花蓼水提取物对CYP450的抑制和诱导作用[8]。
本实验结果表明,头花蓼水提取物对人肝微粒体CYP450无抑制作用,而在ICR小鼠体内对CYP2C9和CYP3A4产生诱导作用。小鼠体内结果与头花蓼水提取物对大鼠体内CYP450酶活性影响的文献报道一致[9]。头花蓼相关制剂均为水提取物,其主要成分为酚酸类和黄酮类,包括原儿茶酸、没食子酸、槲皮素、槲皮苷、杨梅苷、陆地棉苷等,酚酸类化合物没食子酸及黄酮类化合物槲皮素和槲皮苷的单体对CYP450酶的体外活性研究表明,其对CYP2C9和CYP3A4主要为抑制作用[10, 11, 12, 13, 14, 15]。槲皮素对CYP450酶的活性影响虽有许多报道,但大部分报道为槲皮素的单体在体外肝微粒体或原代细胞中对CYP450酶的活性影响,其所使用的槲皮素单体浓度与头花蓼水提取物中的槲皮素浓度也不同,如和凡等[13]关于槲皮素、山奈酚、芦丁对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶的诱导作用研究中,槲皮素单体的低、中、高浓度分别为10、50、250 mg·kg-1,而本水提取物槲皮素含量为1.10 mg·kg-1,浓度差异较大,加之研究对象头花蓼水提取物成分复杂,使得结果不一致。我们又结合中药药物相互作用研究的相关文献,同样以黄酮类成分的中药水提取物如银杏水提取物[16, 17]与黄芩水提取物[18]对大鼠CYP450酶活性的影响,表明对CYP2C9与CYP3A4存在诱导作用。从查阅文献可知,化合物单体与中药提取物、体外实验与体内实验之间对CYP450酶活性影响都存在差异,所以暂时无法推测头花蓼水提取物诱导CYP2C9与CYP3A4活性的化学成分,该部分内容也在进一步的研究中。
综上所述,临床上与以头花蓼为主要原料的单方制剂(如热淋清颗粒)联合用药时,不会出现由于抑制作用导致的药物不良反应,但可能使CYP2C9和CYP3A4的底物药物代谢过快,而导致药效降低。
[1] | 李咏梅, 龚 元. 头花蓼的化学成分及药理研究进展[J]. 贵州大学学报, 2007, 24(2):57-8. Li Y M, Gong Y. Progress in study on chemical constituent and pharmacological activity of Polygonum capitatum [J]. J Guizhou Univ, 2007, 24(2):57-8. |
[2] | 谢海棠, 贾元威, 谭志荣, 等. 豆腐果苷对人肝微粒体CYP450酶体外抑制作用研究[J]. 中国医院药学杂志, 2011, 31(17): 1404-7. Xie H T, Jia Y W, Tan Z R, et al. Determination the inhibition potency of helicidum on human liver cytochrome P450[J]. China J Hosp Pharm, 2011, 31(17): 1404-7. |
[3] | 艾常虹, 孙汉雄, 李 桦, 等. 中药有效成分对细胞色素P450酶的抑制活性评价[J]. 中国药理学通报, 2011, 27(4):519-23. Ai C H, Sun H X, Li H, et al. Evaluation the inhibitory activity of Chinese medicine effective constituents on cytochrome CYP450[J]. Chin Pharmacal Bull, 2011, 27(4): 519-23. |
[4] | 唐 丽, 刘 跃, 郑 林, 等. 热淋清颗粒中5个成分的UPLC-MS/MS法测定[J]. 中国医药工业杂志, 2013, 44(10): 1029-32. Tang L, Liu Y, Zheng L, et al. Determination of five components in relinqing granules by UPLC-MS/MS[J]. Chin J Pharmaceut, 2013, 44(10): 1029-32. |
[5] | 梁瑞峰, 田 鑫, 贾琳静, 等. 刺五加注射液对大鼠肝CYP3A活性的影响[J]. 中国医院药学杂志, 2012, 32(2):120-3. Liang R F, Tian X, Jia L J, et al. Effect of ciwujia injection on the activity of CYP3A in rats[J]. Chin Hosp Pharm J, 2012, 32(2): 120-3. |
[6] | 李 娟, 张耀庭, 曾 伟, 等. 应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J]. 中国生物制品学杂志, 2000, 13(2):118-20. Li J,Zhang Y T,Zeng W,et al.The application of coomassie brilliant blu method to determinate total protein content[J]. Chin J Biol, 2000, 13(2): 118-20. |
[7] | 黄 勇, 陆 苑, 郑 林, 等. 灯盏乙素苷元在大鼠肝微粒体中酶促反应动力学和对CYP3A的影响[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(11):1622-3. Huang Y, Lu Y, Zheng L, et al. Enzyme kinetics of scutellarein aglycone in rat liver microsome and effects of scutellarein aglycone on rats CYP3A activity in vitro[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29(11):1622-3. |
[8] | Turpeinen M, Ghiciuc C, Opritoui M, et al. Predictive value of animal models for human cytochrome P450 (CYP450) mediated metabolism: a comparative study in vitro [J]. Xenobiotica, 2007, 37(12): 1367-77. |
[9] | Zheng L, Lu Y, Cao X, et al. Evaluation of the impact of Polygonum capitatum, atraditional Chinese herbal medicine, on rat hepatic cytochrome P450 enzymes by using a cocktail of probe drugs[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 158: 276-82. |
[10] | 叶林虎, 闫明珠, 孔令提, 等. 槲皮素及其糖苷类化合物对 P450 酶活性的体外抑制作用[J].中国药学杂志, 2014, 49(12): 1051-5. Ye L H, Yan M Z, Kong L T, et al. In vitro inhibition of quercetin and its glycosides on P450 enzyme activities[J]. Chin Pharm J, 2014, 49(12): 1051-5. |
[11] | 毕云枫, 朱洪彬, 皮子凤, 等. UPLC-MS/MS 结合多探针底物方法研究刺五加叶中黄酮苷类成分对 CYP450 活性的影响[J]. 高等学校化学学报, 2013, 34(5): 1067-71. Bi Y F, Zhu H B, Pi Z F. et al. Effect of flavonoids in Acanthopanax leaf on CYP450 activities by cocktail probe drugs with UPLC-MS/MS[J].Chem J Chin Univ, 2013, 34(5): 1067-71. |
[12] | 张芳芳, 郑一凡, 祝慧娟, 等. 山奈酚和槲皮素对大鼠细胞色素P450酶活性的影响[J]. 浙江大学学报(医学版), 2006, 35(1): 18-22. Zhang F F, Zheng Y F, Zhu H J, et al. Effects of kaempferol and quercetin on cytochrom 450 activities in primarily cultured rat hepatocytes[J]. J Zhejiang Univ, 2006, 35(1): 18-22. |
[13] | 和 凡, 钟国平, 赵立子, 等. 槲皮素, 山奈酚, 芦丁对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶的诱导作用[J]. 中国医院药学杂志, 2010, 30(9): 728-31. He F, Zhong G P, Zhao L Z, et al. Inductive effect of quercetin, kaempferol and rutin on liver microsomal cytochrome P450 enzymes in rats[J]. Chin Hosp Pharm, 2010, 30(9): 728-31. |
[14] | Zhou J Q, Tang Z Q. Effect of quercetin on CYP1A2, CYP2E1, CYP3A2 activities and its nhibitory mechanism studies in rat liver microsomes[J]. J Chin Pharmaceut Sci,2005, 14(4): 231-6. |
[15] | 石 亮, 张远冬, 王二豪, 等. 没食子酸及其氧化产物对大鼠肝微粒体 CYP3A 的抑制效应[J]. 第三军医大学学报, 2014,36(2): 130-4. Shi L, Zhang Y D, Wang E H, et al. Inhibitory effect of gallic acid and its oxidation products on CYP3A in rat liver microsomes[J]. J Third Mil Med Univ, 2014, 36(2): 130-4. |
[16] | Deng Y, Bi H C, Zhao L Z, et al. Induction of cytochrome P450 3A by the Ginkgo biloba extract and bilobalides in human and rat primary hepatocytes[J]. Drug Metab Lett, 2008, 2(1): 60-6. |
[17] | 袁 凤, 王 蓉, 王世明, 等. 银杏叶提取物及其黄酮类单体对 Chang Liver 细胞中CYP3A4 和 CYP2C9 的影响[J]. 中南药学,2013, 11(11): 801-6. Yuan F, Wang R, Wang S M, et al. Effect of GBE and its flavonoids on CYP3A4 and CYP2C9 expressions in Chang liver cells[J]. Cent S Pharm, 2013, 11(11): 801-6. |
[18] | 呼自顺, 王 琤, 张 弋, 等. Cocktail探针药物法评价黄芩对大鼠CYP450活性的影响[J]. 中国医院药学杂志, 2010, 30(2): 108-10. Hu Z S, Wang Z, Zhang Y, et al. Simultaneous evaluation of the influence of scutellaria baicalensis Georgi on CYP450 by cocktail probe drugs[J]. Chin Hosp Pharm, 2010, 30(2): 108-10. |