缺血性脑中风是一种发病率和死亡率都较高的脑血管病，阐明其发病机制、探索有效的防治措施一直是研究的热点。由活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起的氧化应激是脑缺血/再灌注(ischemia reperfusion，I/R)损伤发生的重要机制之一。以往多数研究采用自由基清除剂或者天然抗氧化剂来减轻氧化损伤，但并不能产生理想的效果，近来越来越多的研究者关注ROS的来源。有报道表明，在脑缺血时ROS主要由黄嘌呤氧化酶产生，恢复血流再灌注时ROS则主要是由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶产生[1]。因此，NADPH氧化酶成为研究如何减轻脑I/R损伤的热点。有报道表明，抑制NADPH氧化酶能够减轻脑I/R损伤，但具体的作用机制尚不明确[2]。
神经元是脑I/R损伤过程中最为敏感的细胞，它对I/R耐受性低。研究发现，脑I/R过程中往往伴随着神经元缝隙连接蛋白Cx36的蛋白表达异常[3]。进一步研究发现，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)可以磷酸化Cx36蛋白的特殊位点，从而改变缝隙连接通道的耦合[4]。有报道表明，改变Cx36的蛋白表达以及神经元缝隙连接通道的耦合能够明显减轻脑I/R损伤[3]。但是尚未有报道表明，抑制NADPH氧化酶对脑I/R损伤的保护作用是否与PKC激酶和Cx36蛋白表达有关。研究表明脑I/R过程中往往伴随着ROS生成增加，ROS的过度释放能够调控Bcl-2家族参与细胞凋亡[5, 6]。抑制NADPH氧化酶能够减少ROS的生成，那么，抑制NADPH氧化酶对脑I/R损伤的保护作用是否与调控Bcl-2家族参与凋亡有关？本文探讨抑制NADPH氧化酶保护脑I/R损伤的可能机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级♂ SD大鼠52只，体质量(300±20) g，安徽医科大学实验动物中心提供[动物许可证号：SCXK(皖)2011-002]。
1.1.2 主要试剂Apocynin和Cx36单克隆抗体购于Sigma公司；PKC单克隆抗体购于Abcam公司；Bax、Bcl-2单克隆抗体购自BOSTER公司；TTC(2,3,5,-氯三苯基四氮唑)、β-actin单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗均购于Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯级。
1.2 实验方法 1.2.1 实验分组将52只大鼠随机分为4组：假手术组(sham组)、I/R组、I/R+apocynin组(I/R+Apo组)、I/R+apocynin+PKC抑制剂GF109203X组(I/R+Apo+GF组)，每组13只。
1.2.2 模型制作大鼠称重，腹腔注射水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，颈部正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉，在颈内动脉和颈外动脉分叉约1 mm处做一小切口，将直径0.32 mm的尼龙线插入颈总动脉，再经颈内动脉至大脑中动脉，进线约18～22 mm，栓塞大鼠大脑中动脉，造成局灶性脑缺血。Sham组进行上述操作，但不插入线栓阻断大脑中动脉血流。I/R组缺血2 h后，恢复脑血流再灌注24 h；I/R+Apo组于缺血前15 min尾静脉注射apocynin 2.5 mg·kg-1，其余操作同I/R组。I/R+Apo+GF组于缺血前15 min尾静脉注射apocynin 2.5 mg·kg-1，并于缺血15 min后尾静脉注射PKC抑制剂(GF109203X)80 μg·kg-1，其余操作同I/R组。
1.2.3 神经行为学评估根据文献报道的神经行为功能损伤的评分方法[7]，对缺血2 h再灌注24 h后的大鼠进行神经功能评分(每组13只)。0分：无神经功能缺失症状，活动正常；1分：提尾时手术对侧的前肢内收，不能完全伸直；2分：行走时向手术对侧旋转；3分：行走时向手术对侧倾倒，行动不便；4分：不能自己行走或处于昏迷状态。神经行为评分≥1分为成功模型，评分采用双盲法，由未参与实验分组的成员完成。
1.2.4 脑梗死体积测定大鼠缺血2 h，再灌注24 h后快速断头取脑(每组6只)，将大脑置于-20℃冰箱10 min。自额极2 mm向后连续等距切取6张冠状脑片，间距为2 mm。2% TTC避光染色30 min(37℃)，正常脑组织染为红色，脑梗死组织染为白色。将染色好的脑片放置于4%多聚甲醛溶液中固定保存24 h，逐层拍照。拍照后用Image J软件测量脑片相应部位面积,计算脑梗死体积百分率。计算公式：脑梗死体积百分率/%=[对侧大脑皮质的面积-(同侧大脑皮质的面积-脑梗死的面积)]/对侧大脑皮质的面积×100%[8]。
1.2.5 HE染色法观察脑组织病理形态学变化将脑缺血2 h，再灌注24 h后的大鼠断头取脑(每组3只)，将脑组织进行甲醛固定、石蜡包埋，冠状位切片，片厚5 μm，HE染色，封片，光学显微镜下观察脑组织形态学变化，采集图像。
1.2.6 Western blot检测蛋白表达变化将脑缺血2 h，再灌注24 h后的大鼠断头取脑(每组4只)，夹取右侧大脑脑组织，提取蛋白，进行标准蛋白定量。于100℃加热5 min，每孔取20 μg蛋白样品经15% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，以湿转法电转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，用新鲜配制的含5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液封闭2 h，洗膜，与Cx36(1.25 mg·L-1)、PKC(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶2 000)单克隆抗体共同孵育，4℃过夜，洗涤后山羊抗兔抗体(1 ∶5 000)摇床上室温孵育2 h，β-actin(1 ∶4 000)单克隆抗体室温孵育2 h即可，其二抗为山羊抗鼠抗体(1 ∶1 000)。二抗孵育完毕后，洗膜，将膜与曝光液充分接触。1 min后将膜放入凝胶图像分析系统进行拍照。曝光时间调整在5~10 min之间。采用Bio Imaging system(Gene Genius)对图像进行灰度扫描分析。
1.3 统计学分析采用SPSS 13.0软件分析实验结果，数据资料以
± s表示，计量资料比较进行单因素ANOVA分析，统计图采用Sigma Plot 10.0绘制。
脑I/R后，除sham组大鼠无神经功能缺失症状，其他各组大鼠都有不同程度的神经功能障碍。与sham组相比，I/R组大鼠神经行为学评分明显增高(P < 0.05)。与I/R组相比，I/R+Apo组大鼠的神经行为学评分明显降低(P < 0.01)。与I/R+Apo组相比，I/R+Apo+GF组大鼠的神经行为学评分则明显增高(P < 0.01)(Tab1)。
± s,n=13)
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0 | 1 | 2 | 3 | 4 | ± s |
| **P＜0.01 vs I/R group; ##P＜0.01 vs I/R+Apo group | ||||||
| Sham | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| I/R | 0 | 0 | 3 | 9 | 1 | 2.84±0.55 |
| I/R+Apo | 0 | 8 | 4 | 1 | 0 | 1.46±0.66 ** |
| I/R+Apo+GF | 0 | 3 | 6 | 4 | 0 | 2.08±0.75 ## |
如Fig1A结果显示，TTC染色后，大鼠大脑脑梗死区域呈白色，非梗死区域呈红色。梗死灶主要位于缺血侧大脑皮质、基底节和海马区域。用Image J软件测量脑片相应部位面积，计算脑梗死体积百分率。Sham组大鼠大脑无明显梗死，I/R组大鼠脑梗死明显，脑梗死体积百分率最高。与I/R组相比，I/R+Apo组大鼠大脑梗死体积明显减少，脑梗死体积百分率明显降低(P < 0.05)。与I/R+Apo组相比，I/R+Apo+GF组大鼠脑梗死体积百分率明显增加(P < 0.05)(Fig1B)。
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Fig.1
Effect of inhibition of NADPH oxidase on the brain infarct volume of rats with cerebral I/R injury detected by TTC staining( ± s,n=6)
A: Slices of brain tissue,a:sham;b:I/R;c:I/R+Apo;d:I/R+Apo+GF; B: Quantitative analysis of brain infarct volume. *P＜0.05 vs I/R group; #P＜0.05 vs I/R+Apo group.
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采用HE染色法观察大鼠脑组织病理形态学的变化。如Fig2所示，sham组大鼠脑组织中细胞排列整齐、均匀，细胞核圆形，细胞层次清晰；与sham组相比，I/R组大鼠脑组织中细胞的细胞核明显固缩，细胞层次混乱；与I/R组相比，I/R+Apo组大鼠脑组织中细胞的细胞核固缩有所减轻，细胞层次清晰；与I/R+Apo组相比，I/R+Apo+GF组大鼠脑组织病理形态学损伤明显增强。
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| Fig.2 Effect of inhibition of NADPH oxidase on the pathological morphological changes of rats with cerebral I/R injury observed by HE staining A:Sham;B:I/R;C:I/R+Apo;D:I/R+Apo+GF |
采用Western blot检测Cx36、PKC以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表达变化。与sham组相比，I/R组大鼠的Cx36、PKC蛋白表达明显降低(P < 0.05)，但是Bax/Bcl-2的比值明显增高(P < 0.05)。与I/R组相比，I/R+Apo组大鼠的Cx36、PKC蛋白表达明显增高(P < 0.05)，Bax/Bcl-2的比值则明显降低(P < 0.05)。与I/R+Apo组相比，I/R+Apo+GF组大鼠的Cx36、PKC蛋白表达明显降低(P < 0.05)，但是Bax/Bcl-2的比值明显增高(P < 0.05) (Fig3、4)。
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Fig.3
Effect of inhibition of NADPH oxidase on the expression of Cx36 and PKC of rats with cerebral I/R injury detected by Western blot( ± s,n=4)
A: Expression of Cx36 and PKC; B: Quantitative analysis of Cx36; C: Quantitative analysis of PKC. *P＜0.05 vs sham group; #P＜0.05 vs I/R group; △P＜0.05 vs I/R+Apo group.
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Fig.4
Effect of inhibition of NADPH oxidase on the expression of Bax and Bcl-2 protein of rats with cerebral I/R injury detected by Western blot( ± s,n=4)
A: Expression of Bax and Bcl-2 protein; B: Quantitative analysis of the Bax/Bcl-2 ratio. *P＜0.05 vs sham group; #P＜0.05 vs I/R group; △P＜0.05 vs I/R+Apo group.
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NADPH氧化酶广泛分布于大脑神经元细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞以及小胶质细胞，是脑缺血后，恢复血液再灌注时ROS最重要的来源。研究发现，使用NADPH氧化酶抑制剂或敲除NADPH氧化酶的基因可以明显减轻氧化损伤[9, 10]，表明NADPH氧化酶在保护脑I/R损伤方面具有重要意义。Apocynin又叫夹竹桃麻素、罗布麻宁、香荚兰乙酮，是传统中医中的一种天然化合物。研究发现apocynin可以通过阻止p47 phox与NOX 2的组装从而抑制NADPH氧化酶的活化[11]。已有报道表明，apocynin能够减少大鼠脑梗死体积、神经功能缺陷以及细胞凋亡率，从而减轻脑I/R损伤，但具体的作用机制尚不明确[12]。
Cx36是缝隙连接蛋白家族的新成员，主要分布在脑组织以及视网膜。由Cx36组成的缝隙连接是最为常见的神经元细胞间偶联形式，是神经元电信号传导所必需的，而Cx36是唯一一个在神经系统中优先表达的缝隙连接蛋白，因此成为研究神经元缝隙连接功能改变的热点[13]。PKC激酶属于多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，广泛调节各细胞的生理功能。有报道发现，PKC可以磷酸化Cx36蛋白的特殊位点，从而改变缝隙连接通道的耦合[4]。研究表明神经元之间的电耦合很少是静态的，动态变化的程度往往反映在蛋白表达水平的变化上[14]。有报道表明，在脑I/R过程中往往伴随着Cx36蛋白表达以及神经元缝隙连接功能异常，而改变Cx36蛋白表达以及神经元缝隙连接通道的耦合能够明显减轻脑I/R损伤[3]。在心脏以及肾脏组织中主要表达Cx43蛋白，而Src激酶可以使Cx43蛋白磷酸化或直接与Cx43蛋白相结合[15, 16]。有报道表明，NADPH氧化酶的活化可以通过Src激酶下调Cx43蛋白表达造成心肌损伤[15]。在肾病的动物模型中发现NADPH氧化酶的活化可以通过Src激酶上调Cx43蛋白表达，造成足细胞损伤[16]。但是尚未见报道表明在脑I/R过程中，NADPH氧化酶与PKC激酶和神经元缝隙连接蛋白Cx36之间的关系。
本实验结果表明，抑制NADPH氧化酶能够减少大鼠神经行为学评分，降低脑梗死百分率以及减轻脑组织病理形态损伤，从而减轻脑I/R损伤。为了探讨其可能的作用机制，我们采用Western blot检测Cx36、PKC蛋白表达变化。实验结果显示，与I/R组相比，使用NADPH氧化酶抑制剂apocynin后，明显增加大鼠Cx36、PKC的蛋白表达。在使用apocynin的基础上加用PKC抑制剂GF109203X，与单用apocynin相比，Cx36、PKC的蛋白表达明显降低。结果表明，抑制NADPH氧化酶减轻脑I/R损伤可能与增高Cx36、PKC的蛋白表达有关。
脑I/R过程中，ROS生成明显增加，ROS的过度释放可以调控Bcl-2家族参与细胞凋亡[5, 6]。Bcl-2家族能够调控线粒体膜通透性，在细胞的固有凋亡通路中有重要作用，被称为线粒体途径。脑缺血或缺氧后，线粒体膜蛋白的表达增加，促凋亡蛋白Bax从细胞质中进入线粒体，促进细胞色素C的释放。细胞色素C可以和 caspase-9前体的功能前区相互作用，导致caspase-3激活，并进一步激活下游的caspases[17](包括caspases-2、6、8、10)，诱导细胞凋亡。抑凋亡蛋白Bcl-2位于线粒体壁，能够抑制细胞色素C的释放[17]。目前，许多学者用Bax/Bcl-2的比值作为判定细胞凋亡是否被抑制或促进的重要标志[18]。Western blot结果显示，使用NADPH氧化酶抑制剂apocynin后，与I/R组相比，能够降低Bax/Bcl-2的比值。在使用apocynin的基础上使用PKC抑制剂，与I/R+Apo相比，Bax/Bcl-2的比值则明显增高。
综上所述，抑制NADPH氧化酶能够减轻脑I/R损伤,并且能增高Cx36、PKC的蛋白表达，降低Bax与Bcl-2的比值。
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