朱槿花又名扶桑花,岭南地区称之大红花。《本草纲目》中记载:“朱槿,甘,平,无毒,主治痈疽腮肿,可同白芙蓉叶、牛蒡叶、白蜜研膏敷之[1]。” 传统中医药将其归为清热解毒类药用植物,花、叶、根均可入药。临床研究主要用于治疗产后乳房胀痛、化疗性静脉炎[2, 3]、减缓皮肤紫外线照射损伤、抗氧化应激和心肌损伤,以及抗早孕等[4, 5, 6]。课题组在汕头市及周边地区各医院收集临床资料时发现,朱槿花苞在当地医院常用于疮痈的外用治疗,疗效甚至优于百多邦等药,但治疗的文献报道甚少。因此,在调研的基础上,参考临床使用方法,我们利用改良的疖痈溃疡实验动物模型,探讨朱槿花苞对疖痈溃疡的修复作用,并对其可能的作用机制进行了初探。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级昆明小鼠,体质量18~22 g,♀♂各半,购于汕头大学医学院实验动物中心。恒温恒湿饲养。
1.1.2 供试菌株标准金黄色葡萄球菌ATCC29213和铜绿假单胞菌ATCC27853由汕头大学医学院附一医院检验科赠送,恒温隔水培养箱中35℃过夜培养,使用无菌生理盐水配制为0.5麦氏浓度菌液。抗菌实验所使用器具均经高温高压无菌处理。
1.1.3 仪器与试剂上海亚荣生化仪器厂RE-5203旋转蒸发仪,上海浦东荣丰科学仪器公司101A-1型烘箱,沈阳誉德电子仪器公司电脑自动脱水机,广州先尼仪器公司Nikon显微镜,恒温细菌培养箱,苏州净化设备公司超净台,Molecular Device酶标仪SpectraMax M2e 200-100,ZHENGDAER-5758剃毛器。AB-8大孔树脂,体积分数为0.95乙醇(西陇化工有限公司),乙酸乙酯(西陇化工有限公司),氯仿(天津市富宇精细化工有限公司),正丁醇(西陇化工股份有限公司),DMSO(西陇化工有限公司),质量浓度为4 g·L-1多聚甲醛,巴豆油(Sigma 公司),松节油(广州新港化工厂),一得阁墨汁,肝素(江苏万邦生化医药股份有限公司),百多邦软膏(中美史克有限公司),盐酸左旋咪唑(广东华南药业有限公司)。
1.1.4 药材与药物朱槿花苞采摘于汕头大学医学院花圃,并经广州中医药大学中药学院鉴定。鉴定人:广州中医药大学中药学院药用植物教研室彭光天博士。鉴定植物为锦葵科木槿属朱槿Hibiscus rosa-sinensis Linn。
取鲜药500 g,剪碎,1.5 L体积分数0.7~0.8乙醇80℃加热1h后过滤,重复2次,加入1.5 L乙醇加热30 min后过滤,合并滤液,于旋转蒸发仪上45℃蒸干,得朱槿花苞乙醇提取物(HrBA)。将醇提物配制为质量分数0.03的水溶液,按1 ∶1相比分别使用正丁醇、乙酸乙酯萃取7~8次,分别于旋转蒸发仪上浓缩蒸干得HrBN、HrBE浸膏。
AB-8大孔树脂经体积分数为0.95乙醇及HCl溶液、NaOH溶液预处理后,用大量纯化水洗净后湿法装柱。加朱槿花苞醇提液(150 g·L-1)于柱顶,以1 mL·min-1的流速进行动态吸附,吸附平衡后,同等流速下先使用适量水洗脱,再使用2BV体积分数分别为0.3乙醇液、0.6乙醇液、0.95乙醇液洗脱,收集各段洗脱液,于旋转蒸发仪上浓缩即得各洗脱产物浸膏。
1.2 方法 1.2.1 实验模型在药理实验肉芽肿模型的基础上[7],改良疖痈动物模型:小鼠腹腔注射质量浓度100 g·L-1水合氯醛(0.4 mg·g-1)麻醉,背部褪毛(3 cm×3 cm),使用含体积分数0.002巴豆油的松节油合剂,1 mL胰岛素注射器于每只小鼠背中部脊椎处皮内注射0.06 mL,以出现白色疖痈伴红肿,且脓包上切面高出周围皮肤1~2 mm为造模完成标准。
全层切除皮肤创伤模型[8]:小鼠腹腔注射质量浓度100 g·L-1水合氯醛(0.4 mg·g-1)麻醉,背部褪毛(3 cm×3 cm),医用酒精清洁小鼠皮肤,使用直径4 mm的打孔器于小鼠背部脊椎处切除同样直径的圆形皮肤组织,以露出筋膜为准。
1.2.2 朱槿花苞正丁醇萃取物(HrBN)对疖痈模型小鼠作用研究昆明小鼠30只,♀♂各半,随机分为模型组、百多邦组、HrBN组(150 g·L-1),每组10只。造模3 h后于造模疖痈处给药1次,分别涂抹溶剂0.3 mL、百多邦约0.2 g、HrBN药液0.3 mL,造模次日记录为给药d 1,d 1~3每日给药2次,d 4~9每日给药1次,共用药9 d,d 10观察康复情况。
1.2.3 HrBN对创伤溃疡模型小鼠作用研究昆明小鼠150只,♀♂各半,随机分为模型组、百多邦组、HrBN低、中、高浓度组(40、80、160 g·L-1),每组30只。采用全层切除小鼠模型,造模3 h后于造模创伤处给药1次,分别涂抹溶剂0.3 mL,百多邦约0.2 g,HrBN低、中、高浓度药液0.3 mL,造模次日记录为给药d 1,d 1~3每日给药2次,d 4~9每日给药1次,共给药9 d,d 10观察各组创口修复情况。
1.2.4 皮肤样本组织切片观察各组小鼠于d 10观察康复情况后处死,取造模处皮肤肉芽组织或瘢痕组织(约1 cm2)于包埋盒中,用质量浓度为40 g·L-1多聚甲醛固定24 h,后用0.1 mol·L-1的PBS液冲洗浸泡,冲水后进行脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、镜检,分别在×4倍和×40倍显微镜下摄取图像,观察皮肤组织样本纵切面结构。
1.2.5 朱槿花苞提取物抗菌作用研究采用肉汤常量稀释法测定各提取物对两种菌株的最低抑菌浓度(MIC)。实验组:HrBA、HrBN、HrBE、AB-8柱水段,使用体积分数0.05的DMSO溶剂配制600 g·L-1药液,取AB-8柱体积分数0.3乙醇段、0.6乙醇段配制160 g·L-1药液,取朱槿花苞鲜药捣烂得汁液(原汁液),加红糖捣烂得红糖原汁液。对照组:体积分数0.05的DMSO溶剂,红糖对照组:600 g·L-1红糖溶液。阳性药组:苯唑西林250 mg·L-1和头孢他啶4 000 mg·L-1。各组药液均经0.22 μm无菌滤器过滤后使用。向96孔板中分别加入肉汤培养液、菌液和供试药物,从1号孔至10号孔依次进行倍比稀释,将96孔板置于35℃恒温培养箱中,18 h后观察。
分别取两菌株接种于MH琼脂培养基上,每个培养基上均匀放置4个牛津杯,杯中注入20 μL各提取物药液。HrBN、HrBE、AB-8柱体积分数0.3醇段、0.6醇段药液,浓度均为100 g·L-1,且各组药液均经0.22 μm无菌滤器过滤,将培养皿放置35℃恒温培养箱内,20 h后观察。
1.2.6 朱槿花苞提取物对免疫细胞碳粒廓清作用研究昆明小鼠60只,♀♂各半,随机分为对照组(CMC混悬液);盐酸左旋咪唑组(0.03 mg·g-1,浓度1.5 g·L-1);HrBA低剂量(0.3 mg·g-1,浓度20 g·L-1),高剂量(0.6 mg·g-1,浓度40 g·L-1);HrBN低剂量(0.3 mg·g-1,浓度20 g·L-1),高剂量(0.6 mg·g-1,浓度40 g·L-1)。以上各组均灌胃给药,每天1次,每次0.015 mL·g-1,连续给药10 d,末次给药后0.5 h,每只小鼠尾静脉注射经稀释的碳粒墨汁0.01 mL·g-1,于5 min(t1)和15 min(t2)后分别从眼眶静脉丛取血20 μL,加到1.5 mL质量浓度1 g·L-1Na2CO3溶液中震荡摇匀,使用酶标仪在680 nm下检测OD(OD1和OD2)值。小鼠处死后摘取肝、脾,测量肝、脾重,按照公式K=(logOD1-logOD2)/(t2-t1),α=体重/肝、脾重×K1/3,计算廓清指数k和吞噬指数α。
1.3 统计学方法实验数据使用SPSS软件,结果以±s表示,独立样本对比进行t检验,多组间比较进行单因素方差分析,质反应资料进行卡方检验。
2 结果 2.1 HrBN对疖痈模型小鼠的影响肉眼观察结果显示,对比模型组,HrBN可明显促进造模处疖痈康复,见Fig3A。组织切片镜检显示,对比模型组,HrBN可有效减小疖痈创口宽度和加速坏死组织清除,且×4倍镜下观察造模处修复良好,见Fig3B。×40倍镜HrBN组可见较多新生肉芽组织、新生毛细血管和较少的炎症细胞和坏死组织等,见Fig3C。采用药效等级评分法[9],分为康复、有效、进步和无效4级,给药9 d后评分结果显示,HrBN组分数明显高于模型组(P=0.014,P < 0.05),结果见Fig1。
2.2 HrBN对全层切除模型小鼠的影响肉眼观察结果显示,对比模型组,实验组可明显促进皮肤修复,见Fig4A。组织切片镜检结果显示,HrBN可明显减小创口的深度和宽度,×4倍镜检图像见Fig4B。×40倍镜检可见HrBN组上皮组织修复完好以及可见新生肉芽组织和毛细血管等,见Fig4C。给药9 d后各组进行药效等级评分[9],HrBN组药效评分分数均高于模型组,低、中、高3浓度实验组药效分数呈递增趋势,3组间差异具有显著性(P=0.039,P < 0.05),其中高浓度组药效分数明显高于低浓度组(P < 0.05)。模型组、百多邦组、HrBN低、中、高浓度组康复率分别为7.14%、24.14%、20%、30%、46.67%,经卡方检验P=0.013,各组康复率差异有显著性,且药效随药物浓度增加具有量效关系,结果见Fig2。
2.3 朱槿花苞提取物对金葡菌和绿脓杆菌的影响实验结果显示,AB-8柱体积分数0.3乙醇段对金黄色葡萄球菌的抑制作用效果明显,其MIC相对较小,结果见Tab1。HrBE对铜绿假单胞菌的抑制作用最为明显,其MIC相对较小,结果见Tab2。金葡菌抑菌圈结果显示:① HrBN抑菌圈较小,② HrBE无明显抑菌圈,③ AB-8柱体积分数0.3乙醇段抑菌圈明显,④ AB-8柱体积分数0.6乙醇段抑菌圈明显,但小于③。抑菌圈图见Fig5A。铜绿假单胞菌抑菌圈结果显示:(A)HrBN可见抑菌圈,(B)正丁醇水部位未见抑菌圈,(C)HrBE抑菌圈明显,(D)AB-8柱体积分数0.6乙醇段可见抑菌圈,但小于(C)。抑菌圈图见Fig5B。
Group | Antimicrobial activity | MIC |
HrBA | Negative- | |
HrBN | Positive+ | 0.1mg·L-1 |
HrBE | Negative- | |
AB-8 water part | Negative- | |
AB-8 30% alcohol part | Positive+ | 0.002 5 mg·L-1 |
AB-8 60% alcohol part | Positive+ | 0.02 mg·L-1 |
Flower sauce | Negative- | |
Flower sauce add brown sugar | Negative- | |
Brown sugar | Negative- | |
Control | Negative- |
Group | Antimicrobial activity | MIC |
HrBA | Negative — | |
HrBN | Positive + | 0.2 mg·L-1 |
HrBE | Positive + | 0.037 mg·L-1 |
AB-8 water part | Negative — | |
AB-8 30% alcohol part | Negative — | |
AB-8 60% alcohol part | Positive + | 0.08 mg·L-1 |
Flower sauce | Negative — | |
Flower sauce add brown sugar | Negative — | |
Brown sugar | Negative — | |
Control | Negative — |
实验结果显示,与对照组相比,HrBN在300、600 g·L-1浓度下可明显提高吞噬细胞碳粒廓清指数K和吞噬指数α(P < 0.05)。HrBA在300、600 g·L-1浓度下对比对照组,可提高吞噬细胞碳粒廓清指数K和吞噬指数α(P>0.05)。结果见Tab3。
Group | Weight index/mg·g-1 | α | K/10-2 |
Control | 2.511±0.618 | 4.378±1.541 | 1.691±1.238 |
Positive control | 2.777±0.331 | 4.548±0.8797 | 2.059±1.029 |
HrBA 300 g·L-1 | 2.673±0.540 | 5.263±0.5027 | 2.444±1.032 |
HrBA 600 g·L-1 | 2.524±0.449 | 5.011±0.6617 | 2.561±1.001 |
HrBN 300 g·L-1 | 2.587±0.614 | 5.455±0.8843* | 2.623±0.9862* |
HrBN 600 g·L-1 | 2.916±0.337 | 5.469±0.6325* | 2.712±0.5241* |
*P < 0.05 vs control |
疖痈为皮肤及其附属器官感染细菌而引起的病症,溃疡为皮肤或黏膜组织缺失或溃烂病症,均为常见皮肤疾症,临床多使用抗生素如百多邦等防治感染。相对西医疗法,中医药发挥了相对的优势,中药除了防治感染还能够控制炎症、疼痛及促进组织再生等。《周礼》有“疡医下士八人,掌肿疡、溃疡之祝药劀杀之齐。”研究显示,部分中药及其外用制剂能够有效缓解模型动物创伤处的炎症和疼痛[10]。且有研究者总结不少单味中药同时具有抗菌消炎、去腐生肌的作用[11]。
疖痈症研究多采用皮内注射一定浓度菌液而形成的动物模型,此模型重现了由细菌感染所致的皮肤疖痈症,但是其所含菌种较为固定和单一,与自然形成的疖痈有一定差异。且在预试实验中,采用此动物模型出现了若干问题,一是造模12~24 h后未出现明显疖痈脓肿,二是造模12 h后小鼠出现大量死亡。相对而言,本实验使用的化学合剂刺激引起的疖痈模型,不仅较好模拟了疖痈脓肿,并且降低了死亡率,所感染的菌种与自然形成疖痈相似,均不固定。本实验采用经典的全层切除溃疡模型,此模型可用于研究皮肤组织的再生和修复,本实验的操作环境均为自然环境,因此较好地模拟了伴有一定感染的创伤溃疡,且可同时考察药物的皮肤修复作用。
中药发挥疗效往往是从多个方面共同达到治愈疾病的目标,且1种药材尤其花类药材可同时具有多个活性,如常见药材玫瑰花除美白、抗氧化之外,其中的多酚类物质还能够有效地对抗疲劳[12]。现今中药外用作用研究已涵盖抗菌、促进血液循环、增强免疫功能等多方面[11]。实验结果显示,AB-8树脂体积分数0.3醇、0.6醇段、HrBN、以及HrBE具有较好抗菌活性,HrBN的MIC大于AB-8树脂体积分数0.3醇段,但动物实验中发挥最佳疗效的却是正丁醇萃取物。由此可知抗菌作用可能是其作用机制之一,但不是主要作用机制。碳粒廓清实验结果显示,HrBN在低、高剂量下均提高了巨噬细胞廓清能力,证明朱槿花苞免疫增强作用也可能是其作用机制之一,尤其是生肌、修复方面。然而,朱槿花苞具体作用机制仍需进一步深入研究。
实验结果显示,提取物HrBN在实验d 3可见超过半数的小鼠造模处结痂,于d 5,可见约3/4小鼠造模处组织生长良好,部分小鼠可见愈合瘢痕。而模型组则在d 5和d 8才分别达到上述康复程度。综上所述,朱槿花苞提取物促进皮肤疖痈溃疡修复的作用不仅补充了朱槿花系列研究,同时对于后期研发和成为功能型产品奠定了一定的基础。
(致谢:鸣谢中国中医科学院中药所林娜教授在实验过程中的支持与帮助。)
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