内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是能定向分化为血管内皮细胞的前体细胞。大量研究表明，EPCs不仅参与胚胎时期的血管生成,在出生后的血管内皮损伤后的修复和血管新生中都起着重要作用。近来的一些临床前和临床研究报道在四肢和心肌的缺血疾病中，给予EPCs治疗可以促进组织的血管再生^{[1, 2]}。然而研究发现,无论1型还是2 型糖尿病患者均存在EPCs数量减少,增殖能力、黏附能力和血管形成能力的下降，EPCs功能及数量的改变在糖尿病并发症的发生发展过程中起着重要作用^{[3, 4]}。因此,增加糖尿病患者EPCs数量和改善其功能对于糖尿病血管并发症的预防和治疗具有重要意义。

Hedgehog信号通路在胚胎发育期调节细胞的分化、组织的形成和器官的发生，在出生后及成年期可维护组织的稳态及受损后的修复及再生^{[5, 6]}。许多的研究表明^{[7, 8]}，Sonic hedgehog(Shh)信号通路可以促进多种组织中血管的生长，缺血损伤时激活Shh通路可促进血管新生的生成过程。我们之前的研究证实，在1型糖尿病小鼠心肌梗死模型中，给予Shh信号通路受体激动剂SAG，能增加梗死周边区心肌组织毛细血管密度，明显改善心肌梗死后的心脏功能^[9]。那么Shh通路促进糖尿病血管新生的机制是否与EPCs有关，尚未见相关报道。

因此，本实验观察了激活Shh信号通路对糖尿病EPCs增殖、迁移和小管形成等多种功能的影响，旨在探讨Shh信号通路对糖尿病EPCs的影响，阐明其促进糖尿病血管新生的机制。

C57/B6 ♂小鼠为SPF 级，体质量20~23 g，购于广东省医学实验动物中心。

DiI-acLDL购自美国Molecular Probe公司；链脲佐菌素(STZ)、FITC-UEA-1、淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司；EGM-2培养基购自Lonza公司；Sonic hedgehog信号通路Smo受体激动剂SAG购自于美国Merck公司;Shh重组蛋白购自R&D公司。

取7～8周的C57/B6 ♂小鼠，腹腔注射溶于无菌枸橼酸缓冲液(pH 4.5，0.05 mmol·L^-1枸橼酸钠)的STZ，剂量为45 mg·kg^-1。正常对照组给予等量的柠檬酸缓冲液，连续给药5 d。1周后取尾部静脉血，用强生稳豪型血糖分析仪，血糖高于280 g·L^-1者，确认为糖尿病小鼠模型。

成年小鼠经脱颈致死后，无菌解剖分离四肢长骨,生理盐水冲洗骨髓腔，收集细胞。取15 mL离心管，加入淋巴细胞分离液5 mL，将细胞悬液小心加至分离液面上层，2 000 r·min^-1离心30 min。吸取中间白色云雾状层细胞，PBS洗涤2次。用含5% FBS的EGM-2培养基调整细胞密度，以1×10⁹·L^-1的密度接种于包有纤连蛋白的培养皿中，置37℃、5%CO₂培养箱内培养，取培养7 d的贴壁细胞进行后续实验。

取培养d 7原代EPCs，在培养液中加入DiI-acLDL (2.4 mg·L^-1),37℃孵育4 h，用冰冷的75%乙醇固定10 min。加入FITC-UEA-1 (10 mg·L^-1)，室温暗处孵育1 h。PBS洗涤后，在荧光显微镜下观察。

糖尿病和对照小鼠的EPCs加入96孔板，5% CO₂、37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入2 mg·L^-1 Shh重组蛋白和500 nmol·L^-1激动剂SAG，每组设6个复孔。5% CO₂、37℃孵育48 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L^-1)，继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 570 nm处测量各孔的吸光值。

采用改良的Boyden小室法观察细胞迁移情况，用胰蛋白酶消化收集培养的小鼠骨髓EPCs。用EBM培养液制成单个细胞悬液，100 μL(2×10⁸·L^-1)的细胞悬液加入孔径为5 μm的Transwell小室的上室，下室加入10%FBS的1640培养基，加入2 mg·L^-1 Shh重组蛋白和500 nmol·L^-1的SAG。置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，16 h后用棉签擦拭Transwell小室内膜上面未迁移的细胞，100%甲醇固定，0.1% 结晶紫染色，在200倍光学显微镜下随机选取5个视野计数迁移的细胞数。

在冰上用 Matrigel包被24孔培养板，置于培养箱内使Matrigel聚合30 min。用EGM培养液制成单个细胞悬液，每孔加入500 μL细胞悬液，轻拍使细胞分布均匀，加入2 mg·L^-1的Shh重组蛋白和500 nmol·L^-1的SAG，37℃、5% CO₂培养16 h。显微镜下观察并拍照，选取5个视野计数小管长度。

采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老。取培养的正常和糖尿病小鼠EPCs，用EBM培养液制成单个细胞悬液，等量接种24孔板，EGM培养铺满后，换无血清EBM培养48 h。加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育过夜，显微镜下拍照，选取5个视野计数。

所有数据用 ± s表示,采用SPSS 10.0 统计软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。

新鲜分离的单个核细胞呈圆形。d 4起，细胞逐渐拉长，呈梭形生长。d 7时贴壁细胞生长旺盛,多处可见呈“集落”样放射状生长，集落中央细胞圆形，由中央向外周伸展出梭形细胞，细胞呈纺锤形，近似单层生长。培养14 d左右，细胞呈鹅卵石样改变，融合成铺路石样内皮细胞单层(Fig1A)。EPCs的 DiI-acLDL和 FITC-UEA-1双染法鉴定，显示红色荧光的为ac-LDL阳性，显示绿色荧光为UEA-1阳性，显示双荧光阳性(橙黄色)的细胞则认为是EPCs，其比例占贴壁细胞总数的80%以上，证实绝大多数贴壁细胞为EPCs(Fig1B)。

Fig 1 Characteristics of EPCs derived from bone marrow A: EPCs colony formation 7 days post-plating. Adherent early EPCs with spindle shapes. Third-fifth passage cells (late EPCs) showing cobblestone-like morphology (×100); B: Most early EPCs are shown to simultaneously endocytose DiI-acLDL (red) and bind fluorescein isothiocyanate UEA-1 (green) (×100).

图选项

用MTT法检测细胞增殖能力，结果如Fig2所示，糖尿病小鼠EPCs比正常对照组EPCs增殖能力明显减弱(P<0.05)。当给予Shh 通路Shh重组蛋白和激动剂SAG，糖尿病小鼠EPCs增殖能力明显增强加(P<0.05)。

Fig 2 Activating Sonic hedgehog pathway can increase EPCs proliferation in type 1 diabetes(n=4) DM: Diabetes mellitus.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs DM

图选项

用Transwell小室检测EPCs的迁移能力，计数迁移至膜下表面的细胞数。如Fig3所示，糖尿病小鼠骨髓培养的EPCs比正常对照组小鼠EPCs迁移能力明显下降(P<0.05)。当给予Shh通路Shh 重组蛋白和Sonic hedgehog激动剂SAG，糖尿病小鼠EPCs细胞迁移数量明显增加(P<0.05)。

Fig 3 Activating Sonic hedgehog pathway can impove migratory ability of EPCs in type 1 diabetes(n=4) Migratory response of EPCs measured by a modified Boyden chamber migration assay (×40).*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs DM

图选项

体外成血管实验显示，EPCs 具有体外成血管能力，种植于Matrigel 上的细胞首尾相连成条索状，形成血管网样结构。糖尿病小鼠骨髓培养的EPCs比正常对照组小管形成明显减少(P<0.05)。当给予Shh 重组蛋白和激动剂SAG，糖尿病小鼠EPCs形成的血管样结构管腔明显增长(P<0.05)(Fig4)。

Fig 4 Activating Sonic hedgehog pathway can increase EPCs tube formation in type 1 diabetes(n=4) Representative microscopic views of tube formation, defined as tube-like structures exhibiting a length 4 times its width (×40). *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs DM

图选项

采用β-半乳糖苷酶法检测EPCs衰老，染为蓝色的即为衰老细胞。结果如Fig5所示，糖尿病小鼠骨髓培养的EPCs比正常对照组小鼠EPCs衰老明显增多(P<0.05)。给予Shh通路Shh 重组蛋白和Shh激动剂SAG，糖尿病小鼠EPCs衰老细胞数量明显减少(P<0.05)。

Fig 5 Activating Sonic hedgehog pathway can decrease EPCs senescence in type 1 diabetes (×40,n=4) *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs DM

图选项

随着经济高速发展和生活方式的快速转变，糖尿病在中国不仅发病率高，而且处于快速增长阶段。最近的调查表明，目前我国糖尿病患者已有9千多万，准糖尿病患者达1亿4千多万^[10]。代谢紊乱导致的糖尿病血管并发症是糖尿病患者致死、致残的主要原因。如何有效预防和治疗糖尿病血管并发症的发生与发展，成为亟待解决的问题。

1997 年，Asahara 等^[11]首次发现成人外周血中CD34⁺ 细胞能在体外增殖分化为内皮细胞,并命名为内皮祖细胞。1998年,Shi等^[12]报道骨髓来源的CD34⁺细胞亚群可动员入血，并分化为内皮样细胞。由于EPCs的数量极其稀少，纯化困难，体外培养周期短，成功分离培养EPCs成为科研人员研究EPCs的一个难点。我们通过腹腔小剂量注射STZ诱导了1型糖尿病小鼠模型，并经过不同的实验方法，终于通过密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，在体外经EGM培养基培养，成功分离培养出糖尿病小鼠骨髓EPCs。

EPCs具有增殖、迁移能力，并能掺入受损的血管，参与血管的修复和新生。我们首先检测了培养的1型糖尿病小鼠EPCs的这些功能。结果显示，糖尿病小鼠EPCs与正常对照相比，增殖能力减弱，迁移明显下降，小管形成能力明显下降，细胞衰老明显增多，这与之前的研究结果相一致。而当我们将1型糖尿病小鼠EPCs给予Sonic hedgehog蛋白和Smo受体激动剂SAG时，发现糖尿病小鼠EPCs增殖能力增强，迁移数量增多，小管形成能力明显增强，而且细胞衰老减少。这些结果表明激活Sonic hedgehog通路可以明显改善糖尿病小鼠EPCs的功能。

糖尿病患者的外周循环EPCs数量比非糖尿病者的明显减少，这种减少在1型和2型糖尿病患者都被报道^{[13, 14]}。Loomans 等^[15]报道1型糖尿病患者外周血中EPCs数目比正常对照平均降低44%，而且EPCs数目减少的程度与HbA1C的水平呈正相关。我们的研究结果证实1型糖尿病小鼠EPCs

增殖能力减弱，且衰老增多，这些都会导致EPCs数量减少。而激活Sonic hedgehog既可促进糖尿病EPCs的增殖，也减少EPCs的衰老，这都可以增加循环EPCs的数量。Fu 等^[16]报道Sonic hedgehog蛋白通过PI3K/Akt信号通路促进正常EPCs增殖和迁移。而Sonic hedgehog是否通过PI3K/Akt通路促进糖尿病EPCs的增殖，有待进一步研究。

EPCs的迁移能力对其参与血管新生具有重要意义。在血管损伤或组织缺血的情况下，存在于骨髓中的EPCs可以动员并特异性地归巢于损伤或缺血部位，参与血管的修复和新生。我们的实验发现，Sonic hedgehog可以促进糖尿病EPCs的迁移。研究表明CXCR4在EPCs表面高度表达，SDF-1通过与CXCR4结合，促进EPCs的迁移和归巢^[17]。而CXCR4是Sonic hedgehog经典通路的靶基因，Sonic hedgehog可能通过调节CXCR4的表达而促进EPCs的趋化迁移。

EPCs成血管能力的强弱直接关系着血管的自身修复和新生血管的形成。EPCs的成血管能力主要受细胞增殖、黏附及迁移等多种因素的影响。本研究证实激活Sonic hedgehog通路可使糖尿病小鼠EPCs的增殖及迁移能力增强，这都有助于EPCs 的体外成血管能力。

本实验通过给予Sonic hedgehog通路配体蛋白和激动剂，首次证实了激活Shh通路可以促进1型糖尿病小鼠EPCs的增殖，改善其受损的迁移和小管形成能力。激活Sonic hedgehog通路可通过改善1型糖尿病EPCs功能，促进组织的血管修复和新生，恢复缺血组织的功能，为糖尿病血管并发症的治疗提供了新的作用靶点和理论基础。有关Sonic hedgehog作用于糖尿病EPCs的具体分子生物学机制，尚需进一步的研究和探讨。