肝纤维化是持续性肝脏损伤的共同病理改变过程，主要表现为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝脏中的大量沉积，其持续发展可形成肝硬化和肝细胞癌[1]。肝纤维化的形成机制目前尚不清楚，研究表明肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的增殖活化是肝纤维化形成的关键，抑制HSC的增殖活化成为防治肝纤维化的重点[2]。有文献报道，Zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)在纤维化形成中起重要作用[3]。肝纤维化形成过程中，MAPK/ERK和PI3K/AKT通路被激活并起重要作用。研究发现，EZH2能够激活MAPK/ERK和PI3K/AKT通路，从而引起疾病[4]。本研究拟应用EZH2的抑制剂DZNep和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制EZH2的表达，考察其对HSC增殖活化的调控作用，探究其调控机制,以期为肝纤维化的防治提供新的靶点。
1 材料 1.1 细胞株大鼠肝星状细胞株HSC-T6购于南京凯基生物科技发展有限公司。
1.2 试剂与仪器DZNep购于Selleckchem公司；TGF-β1购于 Peprotech公司；噻唑蓝MTT购于Sigma公司；DMSO购于Sigma公司；胰蛋白酶、DMEM培养基为Hyclone公司产品；胎牛血清购于杭州四季青公司；山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司；脂质体LipofectamineTM 2000、Opti-MEM购于Invitrogen公司；EZH2、p-ERK、ERK、p-AKT和AKT抗体购于Cell Signaling公司；α-SMA抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；β-actin抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司；倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司，日本)；酶标仪(bio-tekEL)。
2 方法 2.1 HSC-T6细胞的培养应用含10% 胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行细胞培养，待细胞长至70%～80% 密度时进行细胞传代。
2.2 DZNep的应用加入DZNep 24 h前，将细胞传代至6孔培养板，每孔2×105细胞。实验分正常组、应用TGF-β1刺激的模型组、TGF-β1刺激并加入DZNep的恢复组。正常组不做任何处理；模型组加入TGF-β1刺激终浓度为10 μg · L-1，TGF-β1作用于细胞的时间为48 h；恢复组加入TGF-β1刺激终浓度为10 μg · L-1，并加入DZNep刺激终浓度为1 μmol · L-1，DZNep作用于细胞的时间为24 h。
2.3 siRNA的合成根据siRNA设计原则，设计针对EZH2基因的siRNA序列，在GenBank表达序列标签(EST)数据库应用BLAST检索，并确认所设计siRNA序列的唯一性，靶向目的基因EZH2的序列设计的两条链，正义链：5′-GGGCAUCUUUAUCAAAGAUTT-3′；反义链：5′- AUCUUUGAUAAAGAU GCCCTT-3′。同样方法构建阴性对照组的两条链，正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，与任何编码序列无同源性，由吉玛制药有限公司合成有效siRNA干粉制剂。
细胞培养及siRNA转染HSC-T6细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5% CO2培养。转染24 h前，传代至6孔培养板，每孔2×105细胞。实验分正常组、模型组、阴性对照组和EZH2-siRNA实验组。正常组不做任何处理；模型组加入TGF-β1；阴性对照组转染FAM标记的阴性对照siRNA并加入TGF-β1；实验组转染EZH2-siRNA并加入TGF-β1。用Opti-MEM和脂质体作为转染试剂进行转染，使siRNA终浓度均为100 pmol · L-1，置于37℃、5% CO2培养箱转染6 h后，每组加入完全培养基含TGF-β1使刺激终浓度为10 μg · L-1，继续培养48 h，收获细胞。采用荧光倒置显微镜观察各组转染后的细胞形态并判断转染效果。
2.4 细胞增殖实验以MTT法检测HSC-T6细胞的增殖，分组同上。将培养的HSC-T6细胞以10% 胎牛血清的DMEM制备成1×108 · L-1的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL，过夜，待细胞贴壁后进行细胞转染，转染后6 h换液，每孔加入完全培养基200 μL含TGF-β1使刺激终浓度为10 μg · L-1，37℃、5% CO2培养箱中继续培养12、24、48、72 h，然后每孔加0.5% MTT贮存液20 μL继续孵育4 h，最后弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶解细胞内结晶，置于恒温震荡器上震摇10 min，应用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度值，以空白对照组作为对照组，其细胞存活率为100%，其余各组按：存活率/%=[(各实验组吸光度值-本底吸光度值)/(对照组吸光度值-本底吸光度值)]×100%。
2.5 Western blot检测EZH2、p-ERK、p-AKT、α-SMA蛋白表达细胞的培养、分组、处理同上。DZNep作用24 h或者转染EZH2-siRNA 48 h后，分别提取细胞总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度。应用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，在200 mA恒定电流下应用PVDF膜进行转膜，TBST洗膜后，使用5% 牛奶封闭非特异性结合位点，TBST洗膜后，在4℃于一抗(1 ∶500)中孵育过夜，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或抗兔二抗(1 ∶10 000)室温中孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL发光剂反应20 s，电脑显影成像，实验重复3次或以上。
2.6 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以
± s表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
加入TGF-β1的模型组EZH2蛋白表达水平明显升高，与正常组相比差异有显著性(P<0.01)，加入TGF-β1和DZNep的恢复组EZH2蛋白表达水平明显降低，与模型组相比差异有显著性(P<0.01)，见Fig1A；同时，模型组p-ERK和p-AKT蛋白表达水平明显升高，与正常组相比差异有显著性(P<0.01)，恢复组p-ERK和p-AKT蛋白表达水平明显降低，与模型组相比差异有显著性(P<0.01)，见Fig1B；与此同时，模型组α-SMA蛋白表达水平明显升高，与正常组相比差异有显著性(P<0.01)，恢复组α-SMA蛋白表达水平明显降低，与模型组相比差异有显著性(P<0.01)，见Fig1C。
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| Fig 1 Protein expression of EZH2(A), p-ERK, p-AKT(B) and α-SMA(C) detected by Western blot after application of DZNep 1: normal group; 2: model group; 3: recovery group. **P<0.01 vs normal group; ##P<0.01 vs model group |
MTT实验结果显示，EZH2-siRNA瞬时转染对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖有明显的抑制作用，EZH2-siRNA实验组作用12 h细胞抑制率与阴性对照组、模型组之间差异无显著性(P>0.05)；EZH2-siRNA实验组作用24、48、72 h细胞抑制率明显高于阴性对照组、模型组(P<0.05)。同时，作用24、48、72 h时模型组、阴性对照组与正常组之间差异有显著性(P<0.05)，见Fig2。
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| Fig 2 Proliferation of HSC cells determined by MTT after transfection with siRNA of EZH2 1: normal group; 2: model group; 3: negative control group; 4: EZH2-siRNA experimental group. *P<0.05 vs normal group; #P<0.05 vs negative control group |
瞬时转染EZH2-siRNA 48 h后，EZH2蛋白表达明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性(P<0.01)，阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性(P<0.01)，见Fig3A；同时，EZH2-siRNA实验组p-ERK和p-AKT蛋白表达也明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性(P<0.01)，阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性(P<0.01)，见Fig3B；与此同时，EZH2-siRNA实验组α-SMA蛋白表达也明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性(P<0.01)，阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性(P<0.01)，见Fig3C。
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| Fig 3 Protein expression of EZH2(A), p-ERK, p-AKT(B) and α-SMA(C) detected by Western blot after transfection with EZH2 siRNA 1: normal group; 2: model group; 3: negative control group; 4: EZH2-siRNA experimental group. **P<0.01 vs normal group; ##P<0.01 vs negative control group |
HSC的增殖活化是肝纤维化发生发展的关键环节，抑制HSC的增殖活化成为预防和治疗肝纤维化的重要手段之一[5]。近些年研究发现[6, 7, 8, 9]，表观遗传学(包括DNA甲基化、microRNA和组蛋白修饰等)在肝纤维化的发生发展中扮演重要角色。组蛋白修饰是指在组蛋白相关酶的作用下，组蛋白发生乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等修饰的过程。组蛋白的甲基化修饰是由组蛋白甲基转移酶来实现的，组蛋白的甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，最终可导致基因的转录沉默或转录激活。研究发现[10]，组蛋白的甲基化修饰与HSC的状态及转归密切相关。EZH2是一个重要的组蛋白甲基转移酶，通过特异性甲基化基因启动子区域组蛋白H3赖氨酸27，广泛参与了基因的转录沉默。在癌症的发生发展中，EZH2被认为是一个促癌基因，在子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤中高表达[11, 12, 13]。有研究发现，EZH2在肝纤维化形成中扮演重要角色，但是其具体机制尚不清楚。
有文献报道[14, 15]，在生长因子TGF-β1等的刺激下，MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路被激活，进而影响到大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖活化。有研究发现，EZH2能够激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路从而引起疾病的发生。那么EZH2能否影响TGF-β1诱导的HSC的增殖活化，EZH2通过何种机制影响其增殖活化，目前尚未见文献报道。在该项研究中，应用TGF-β1诱导HSC增殖活化，同时应用EZH2的抑制剂DZNep和siRNA技术，抑制HSC-T6中EZH2的表达，观察EZH2表达下调后对TGF-β1诱导的HSC增殖活化的影响，及其对MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的影响。应用EZH2的siRNA后，与阴性对照组比较，EZH2-siRNA实验组EZH2蛋白表达水平明显降低，表明瞬时转染实验成功。MTT法是评估细胞增殖的一种有效方法，MTT的结果表明，通过siRNA沉默EZH2的表达可明显抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖。α-SMA是HSC活化的特征性标志，Western blot检测结果显示，应用抑制剂DZNep后，可明显降低α-SMA蛋白的表达；靶向干扰HSC-T6细胞中EZH2的表达，可明显降低α-SMA蛋白的表达。表明抑制EZH2的表达能影响TGF-β1诱导的HSC的增殖活化。结果进一步表明，应用TGF-β1刺激HSC-T6细胞可明显升高EZH2蛋白表达水平，也可明显升高p-ERK、p-AKT蛋白表达水平。应用抑制剂DZNep后可明显降低EZH2蛋白表达水平，也可明显降低p-ERK和p-AKT蛋白表达水平。靶向干扰HSC-T6细胞中EZH2基因的表达，可明显降低EZH2蛋白表达水平，也可降低p-ERK和p-AKT蛋白表达水平。表明抑制EZH2的表达能影响TGF-β1诱导的HSC中MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的激活。抑制EZH2的表达能影响MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的激活，是影响TGF-β1诱导的HSC增殖活化的机制。
综上，抑制HSC-T6细胞中EZH2基因的表达，能影响TGF-β1诱导的HSC中MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的激活，从而抑制HSC的增殖活化。本研究从细胞分子水平阐明EZH2对HSC的增殖活化的调控作用及其可能的潜在调控机制。揭示了EZH2在肝纤维化发展中的重要作用，可能成为防治肝纤维化的潜在新靶点，还需要通过其它实验进一步验证。肝纤维化的形成过程非常复杂，EZH2如何调控基因的沉默，尚需进一步深入研究。
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