2. 潍坊医学院 生物科学与技术学院, 山东 潍坊 261053;
3. 潍坊医学院 医学研究实验中心, 山东 潍坊 261053;
4. 潍坊医学院 护理学院, 山东 潍坊 261053
2. College of Biological Science and Technology, Weifang Medical University, Weifang Shangdong 261053, China;
3. Medicine Research Center, Weifang Medical University, Weifang Shangdong 261053, China;
4. College of Nursing, Weifang Medical University, Weifang Shangdong 261053, China
肿瘤细胞从原发病灶脱落，浸润周围组织及发生远处转移是恶性肿瘤难以治愈的关键。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)能够降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，从而促进肿瘤的侵袭和转移。尤其是MMP-2、MMP-9已成为乳腺癌分期、预后的一个重要分子标志[1, 2, 3]。
Gab2支架蛋白是Gabs家族的成员之一，由Gab2(11q14.1)基因编码，研究发现，有10%~15%乳腺癌患者该段染色体存在扩增现象[4, 5]。Gab2蛋白被认为是肿瘤相关蛋白，在胶质瘤[6]、 卵巢癌[7]、白血病[8]中过表达。本课题组已发现Gab2-Akt-ARK5信号通路参与胶质瘤细胞的侵袭转移[9]。而目前对于Gab2在乳腺癌侵袭和转移中分子机制的研究尚未见报道。因此，本实验通过分析浸润性导管癌组织中Gab2蛋白与MMP-2、MMP-9蛋白的相关性，沉默Gab2基因后检测细胞的侵袭性及用EGF刺激后检测Akt及ARK5的磷酸化情况，从而探讨Gab2在乳腺癌的侵袭转移中的作用及可能的分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病例资料收集潍坊医学院附属医院2012年10月～2013年11月80例病理确诊为乳腺浸润性导管癌组织标本及癌旁相对正常乳腺组织(距离肿瘤边缘>5 cm)作为研究对象，患者均为女性，手术前均未行放疗和化疗。年龄 30～74岁(平均 50岁)，临床资料完整。
1.1.2 主要试剂兔抗Gab2单抗购自美国Santa Cruz公司；鼠抗MMP-2单抗、兔抗 MMP-9单抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RPMI 1640培养液和胎牛血清购自美国Hyclone公司；Lipofecter脂质体转染试剂购自碧云天生物技术研究所；Transwell 小室购自 Corning 公司；Matrigel 购自 BD 公司。MDA-MB-231和MCF-7 乳腺癌细胞系由潍坊医学院医学研究实验中心提供。
1.2 方法 1.2.1 免疫组化SP法每例组织切片4张，1张用PBS代替一抗作阴性对照，其余3张滴加Gab2、MMP-2、MMP-9工作液，其余按试剂盒说明书进行。结果判定[10]：根据阳性细胞占5个以上高倍镜视野(400倍)同类细胞的百分比即阳性细胞率和染色强度来判定，阳性细胞率计分：阳性细胞数 ＜5% 为 0 分，5%~25% 为 1分，25%~50% 为 2 分，50%~ 75% 为 3 分，>75%为 4 分。细胞染色强度计分：细胞无着色为 0分，淡黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分。将两项得分结果相加：0~ 1 分为阴性，2~7 分为阳性。
1.2.2 细胞培养MCF-7 及MDA-MB-231细胞常规培养。分组： ①SiGab2/MDA-231组：插入Gab2目的片段5′-GTGAGAACGATGAGAAATA-3′的小RNA干扰质粒的MDA-MB-231细胞；②Scr/MDA-231组：插入对照小RNA干扰质粒的MDA-MB-231细胞。
1.2.3 Western blot细胞转染后培养24 h，裂解提取细胞总蛋白，制备12%SDS-PAGE凝胶，各组加入等量蛋白后电泳，转膜、封闭，滴加一抗Gab2、MMP-2、MMP-9孵育过夜，二抗孵育后化学发光剂显影，曝光。
1.2.4 Transwell侵袭实验按文献[11]操作后将小室置高倍镜(400 ×)下观察，随机计数5 个高倍镜视野下穿过人工基膜的细胞数，每个实验重复 3 次，取平均数作为实验结果。
1.3 统计学分析实验数据均采用 SPSS 17. 0进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用独立样本t检验。
2 结果 2.1 Gab2蛋白在乳腺浸润性导管癌和癌旁正常乳腺组织中的表达Gab2蛋白在肿瘤细胞的细胞质中呈棕黄色阳性反应，在乳腺浸润性导管癌组织中阳性表达率为56.25%(45/80)，在癌旁正常组织中阳性表达率为32.50%(26/80)(Fig1A、D)，差异具有统计学意义(P=0.002)。并且Gab2的表达与ER、淋巴结转移及组织学分期有关(P＜0.05，Tab1)。
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| Fig.1 Expression of Gab2,MMP-2 and MMP-9 in breast tissue by immunohistochemical staining(×400) A: Negative expression of Gab2 in normal breast tissue; B:Positive expression of MMP-2 in normal breast tissue; C: Positive expression of MMP-9 in normal breast tissue; D:Positive expression of Gab2 in invasive ductal carcinoma tissue; E:Positive expression of MMP-2 in invasive ductal carcinoma tissue; F:Positive expression of MMP-9 in invasive ductal carcinoma tissue |
| Clinical parameters | n | Gab2 | χ 2 | P | |
| + | - | ||||
| Age/years | |||||
| ≤55 | 62 | 33 | 29 | 1.024 | 0.230 |
| >55 | 18 | 12 | 6 | ||
| Tumor size/cm | |||||
| ≤2 | 26 | 17 | 9 | 1.306 | 0.184 |
| >2 | 54 | 28 | 26 | ||
| Lymph node metastasis | |||||
| No | 56 | 27 | 29 | 4.898 | 0.023 |
| Yes | 24 | 18 | 6 | ||
| ER | |||||
| + | 58 | 33 | 25 | 0.036 | 0.523 |
| - | 22 | 12 | 10 | ||
| PR | |||||
| + | 58 | 33 | 25 | 0.036 | 0.523 |
| - | 22 | 12 | 10 | ||
| Histological grade | |||||
| Ⅰ~Ⅱ | 45 | 20 | 25 | 5.825 | 0.014 |
| Ⅰ~Ⅱ | 35 | 25 | 10 | ||
MMP-2、MMP-9阳性染色部位在细胞质，细胞膜中，呈棕黄色，在浸润性导管癌中Gab2蛋白表达增多的组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达也增多，在Gab2蛋白表达减少的组织中，MMP-2、MMP-9蛋白表达也减少，两者的表达呈正相关(Fig1B、C、E、F)(Tab2)。
| Gab2 | r | P | ||
| + | - | |||
| MMP-2 | ||||
| + | 31 | 11 | 0.372 | 0.001 |
| - | 14 | 24 | ||
| MMP-9 | ||||
| + | 29 | 10 | 0.356 | 0.001 |
| - | 16 | 25 | ||
Gab2蛋白在侵袭性强的MDA-MB-231细胞中表达量高于侵袭性弱的MCF-7细胞中的表达量(Fig2)。
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| Fig.2 Expression of Gab2 in MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells (Values represent gray value) |
Gab2在SiGab2/ MDA-MB-231细胞组中表达明显低Scr/MDA-MB-231细胞组中表达，表明转染成功；同时在SiGab2/MDA-MB-231细胞组中 MMP-2、MMP-9蛋白表达下降；差异有显著性(Fig3)。
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| Fig.3 Expression of Gab2，MMP-2 and MMP-9 in transfected cells by Western blot (Values represent gray value) |
细胞侵袭性的影响 转染干扰质粒后应用Transwell检测结果显示：SiGab2/MDA-MB-231组穿过人工基膜的细胞数比Scr/MDA-MB-231组明显减少(Fig4)，差异有显著性(P＜0.05)
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| Fig.4 Invasion ability of each group transfected MDA-MB-231 cells (Giemsa×200) A： Scr/MDA-MB-231 cells；B： SiGab2/MDA-MB-231 cells；C： The number of invasive cells in SiGab2/MDA-MB-231 decreased compared with Scr/MDA-MB-231.*P<0.05 vs Scr/MDA-MB-231 |
为研究Gab2在乳腺癌侵袭与转移中的信号通路，本实验采用10 μg·L-1 EGF无血清培养基分别刺激各组细胞5、10 min，结果显示，EGF刺激后，Scr/MDA-MB-231 细胞组Akt、ARK5的磷酸化增强；而SiGab2/MDA-MB-231细胞组中Akt、ARK5磷酸化明显受到抑制(Fig 5)。
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| Fig.5 Difference of phosphorylation of ARK5 and Akt induced by EGF in transfected MDA-MB-231 cells (Values represent gray value) |
乳腺癌是严重危害女性健康的常见肿瘤，其发病率逐年升高，肿瘤的浸润与转移是患者死亡的主要原因，研究其发病机制，对于设计靶向阻断药物极为重要。
多项研究表明，Gab2是肿瘤相关蛋白，它的异常活化和表达促进肿瘤的发生、转移。Matsumura等[12]发现，Gab2在结肠癌组织中高表达，Gab2表达高的患者生存期明显低于低表达者。已有研究发现ARK5与MMP-2、MMP-9协同表达促进乳腺癌的侵袭转移[13]。本实验结果显示，乳腺浸润性导管癌中Gab2蛋白的表达明显高于癌旁正常乳腺组织，并且其表达与淋巴结转移、ER表达及组织学分期明显相关，与郑雄伟等[10]研究结果一致。同时检测到Gab2蛋白表达高的组织中伴有MMP-2、MMP-9蛋白表达增高，Gab2蛋白与MMP-2、MMP-9蛋白表达呈正相关。结果提示Gab2蛋白表达与乳腺癌的侵袭转移相关。
体外研究发现，乳腺癌细胞中 Gab2 蛋白表达高低与肿瘤细胞侵袭相关。Bocanegra等[14]将内源性 Gab2 基因沉默后，乳腺癌细胞系(SUM52,SUM44PE 和MDA-MB-468)细胞周期分裂减缓，增殖及侵袭减弱，凋亡加快。Daly等[15]发现Gab2蛋白在乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-361和MDA-MB -453)中表达高于正常乳腺上皮细胞中表达。本实验Western blot检测结果显示，侵袭性强的MDA-MB-231细胞中Gab2蛋白表达高于侵袭性低的MCF-7细胞中表达。当采用小RNA干扰技术沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中的内源性Gab2基因后，Western blot检测SiGab2/MDA-MB-231细胞组Gab2蛋白表达降低，同时伴有MMP-2、MMP-9蛋白表达也降低；Transwell检测结果显示，SiGab2/ MDA-MB-231细胞组穿过人工基质膜的细胞数明显低于Scr/MDA-MB-231细胞组。以上结果提示，Gab2蛋白表达通过影响MMP-2、MMP-9蛋白的表达参与乳腺癌细胞的侵袭。
Gab2结构中含多个酪氨酸残基，可被酪氨酸磷酸化活化，之后招募下游多种蛋白分子，其中活化的Gab2可与PI3K的p85亚基结合，进而活化Akt等下游信号传导通路，参与肿瘤的侵袭、转移。Daly等[16]用 HRGb1刺激乳腺癌MCF-7细胞后，发现酪氨酸磷酸化的Gab2明显增加，促进细胞的增殖。本实验在沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中的Gab2后，用EGF刺激各组细胞5 min，Western blot检测结果显示，SiGab2/MDA-MB-231细胞组中Akt/ARK5的磷酸化明显受抑制。结果提示Gab2参与PI3K/ Akt / ARK5信号传导通路。
综上所述，本实验证实Gab2在乳腺浸润性导管癌中高表达，Gab2参与PI3K/Akt/ARK5信号传导通路，进而影响MMP-2、MMP-9蛋白的表达促进乳腺癌的侵袭转移。因此，降低Gab2蛋白表达将有望成为控制乳腺癌侵袭转移的靶点。
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