2. 辽宁医学院附属第一医院, 辽宁 锦州 121000;
3. 中国医科大学, 辽宁 沈阳 110001
2. The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou Liaoning 121000, China;
3. The China Medical University, Shenyang 110001, China
吗啡等阿片类药物反复应用可造成耐受、依赖和成瘾，中断给药出现戒断综合征、强迫觅药行为及戒断后焦虑等精神神经系统症状。在阿片类药物的成瘾过程中，中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)起到重要的作用[1]。VTA靠近黑质与红核，含有大量DA能神经元。针对吗啡强化和依赖效应主要通过VTA的DA系统介导，VTA神经元的异常兴奋是吗啡成瘾的关键环节，但目前机制尚不清楚[2]。神经内分泌活性肽UCN是近年来发现的促皮质激素释放因子(coticortropin-releasing factor,CRF) 肽类家族的一个新成员[3]。UCN 具有与CRF 相似的生物活性，通过下丘脑-腺垂体-肾上腺轴，促进腺垂体分泌肾上腺皮质激素，调节应激、应急反应、抗焦虑、镇静等作用。UCN作为一种新型的小分子神经活性肽，通过自分泌和(或)旁分泌途径，其作用是广泛的，相应作用机制也是多方面的[4]。有少量报道表明，UCN参与酒精成瘾及戒断后焦虑和觅药等行为的应激性反应[5]。但UCN对吗啡成瘾VTA神经元电活动及DA系统的影响未见报道，且机制也不明确。因此，本实验采用七管玻璃微电极细胞外记录方法，微电泳UCN2及CRF2受体抑制剂AST对VTA 神经元放电情况的影响，同时也观察了UCN2对VTA中DA能神经递质传递的影响，以探讨VTA内存在的复杂的神经纤维联系及各种神经递质之间的相互作用，从而为VTA神经元放电异常及发作性疾病的诊治提供电生理学方面的依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物♂ Sprague-Dawley(SD)大鼠，50只，体质量180～220 g，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(辽) 2003-0007。随机分为吗啡成瘾模型组40只和对照组10只。模型组采用剂量序贯递增法腹腔注射盐酸吗啡(Tab1)建立大鼠吗啡成瘾模型，对照组在相同条件下给予生理盐水，12 d后采用纳洛酮(5 mg·kg-1)诱导吗啡成瘾戒断模型[6]。
| Time | d1 | d2 | d3 | d4 | d5 | d6 | d7 | d8 | d9 | d10 | d11 | d12 |
| Morning/mg·kg-1 | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 35 | 45 | 55 | 65 | 75 | 85 |
| Afternoon/mg·kg-1 | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 35 | 45 | 55 | 65 | 75 | 85 |
| Evening/mg·kg-1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 40 | 50 | 65 | 70 | 80 | 90 |
细胞外记录及微电泳采用51-217 型微管拉制仪(美国STOELTING公司)所拉制的7管玻璃微电极。中心管尖端直径在4～8 μm，电阻为5～12 MΩ，管内灌注含1%滂胺天蓝的NaCl溶液(3.0 mol·L-1)作为神经元放电活动的引导电极；外周管电阻为20-100MΩ，外周管内灌注下列药物，包括：UCN2(10-6 mol·L-1)；astressin2B-AST-2B(CRF-2受体阻断剂，10-6 mol·L-1)；DA及其非选择性阻断剂α-flupenthixol(FLU,10-5 mol·L-1)，蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)及抑制剂(H-89,10-5 mol·L-1)。
1.3 实验方法上述实验动物用20%乌拉坦(1 g·kg-1)麻醉后，于脑立体定位仪上行常规开颅。根据Paxions Watson大鼠脑图谱，确定VTA核团位置，坐标为前囟后5.20~6.80 mm，中线旁开0.20~0.80 mm，脑表下7.0~8.0 mm。应用微电极推进器将七管微电极缓慢插入VTA，神经元单位放电经DAM80 微电极放大器采集及滤波后显示于示波器上，再经Spike2 生物信号采集系统(英国CED公司)输入计算机并处理，生成序列密度直方图。观察吗啡成瘾大鼠VTA神经元放电情况，之后观察UCN2及AST-2B对VTA神经元放电影响。另外，微电泳DA及其阻断剂期间，给予UCN2对VTA神经元多巴胺能神经传递的影响；微电泳PKA及抑制剂H-89，进一步观察UCN2对吗啡成瘾大鼠VTA神经元影响是否通过PKA发挥作用。为排除可能发生的电流影响，只要注入生理盐水引起的任何放电改变，则该资料不列入统计之内。
1.4 数据处理及统计记录微电泳药物前、后VTA神经元放电频率改变，微电泳药物后放电频率变化/%=(微电泳药物期间放电频率-微电泳前20s放电频率)/微电泳前20s 放电频率×100%，电泳药物后放电变化超过±30%为有效临界值。
采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学处理。所有数据以用
± s表示。组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验进行统计学处理。
实验中，共计观察了52个吗啡成瘾大鼠VTA神经元的自发放电活动，其自发放电频率快而且不规则，VTA神经元放电频率在10～25Hz之间，多为单个爆发式放电。
2.1 微电泳UCN2及AST对VTA神经元自发放电的影响本结果中，共观察了38个吗啡成瘾大鼠的VTA神经元。微电泳UCN2(10-6 mol·L-1，20nA，20s)使82%(31/38)神经元自发放电频率减慢，对7个神经元无作用。38个受试VTA神经元的平均放电频率由微电泳前的(20.89±2.86)Hz减少到(13.66±3.93)Hz，给药前后放电频率降低具有显著性(P＜0.01)。实验中发现，UCN2的抑制作用较明显，几乎没有潜伏期，但存在后作用。此外，在22个VTA神经元中单独微电泳AST(10-6 mol·L-1,20nA，20s)，可使73%(16/22)VTA神经元自发放电频率升高。受试VTA神经元放电频率由微电泳前的(21.64±2.82)Hz升高到(24.25±2.30)Hz(P＜0.01)，在微电泳UCN2造成抑制效应的20个神经元中，微电泳UCN2(20nA，40s)期间给予AST(20nA，20s)可拮抗UCN2 的抑制效应，使80%(16/20)对UCN2产生抑制效应的神经元放电频率明显加快，放电频率由微电泳AST前的(13.35±1.89)Hz增加到(17.80±2.53)Hz，微电泳前后平均放电频率改变具有显著性(P＜0.01)。AST的起效迅速，无潜伏期，可引起爆发式放电，并可见双向动作电位增加(Fig1A,1B)。
|
| Fig 1 Effects of UCN2 on VTA neuron A：Effects of UCN2 (10-6 mol·L-1, 20nA, 20s) and AST-2B on VTA neuron. **P＜0.01 vs normal group; ##P＜0.01 vs UCN2 group,B：Effects of UCN2 on VTA neuron spontaneous firing rates. AST-2B was administrered during the period of UCN2. |
微电泳DA可使吗啡成瘾大鼠VTA神经元兴奋性进一步升高，而给予DA非选择性阻断剂可拮抗其兴奋效应。选取对DA产生兴奋效应的24个VTA神经元进行研究。在微电泳DA(20nA，40s)期间，在第20s微电泳UCN2(20nA，20s)，使受试神经元中的79%(19/24)的放电频率明显降低。受试VTA中DA神经元的放电频率由微电泳UCN2前(25.57±1.64)Hz减少到(13.42±1.60)Hz，给药前后放电频率差异有显著性(P＜0.01)。微电泳DA的阻断剂FLU可使DA神经元放电频率明显降低，在微电泳期间给予UCN2(20nA，20s)，对受抑制的VTA神经元中放电频率无明显影响，平均放电频率由微电泳UCN2前的(13.88±1.80)Hz变化到(13.46±1.78)Hz，给UCN2前后差异无显著性(P＞0.05)(Fig2A,2B)。
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| Fig 2 Effects of UCN2 on DA neuron A：Effects of UCN2 (10-6 mol·L-1, 20nA, 20s) on VTA′s DA neuron; **P＜0.01 vs normal group; ##P＜0.01 vs UCN2 group. B：Effects of UCN2 on VTA′s dopaminergic neuron spontaneous firing rates. FLU could inhibit VTA neuron spontaneous firing rates, and UCN2 was administrered during the microiontophoresis of FLU. |
对DA产生兴奋效应的19个VTA神经元进行研究。在微电泳DA(20nA，80s)期间，在第20s微电泳H89 (20 nA，40s)，使受试神经元中的79%(15/19)的放电频率由微电泳H89前(25.50±1.58)Hz减少到(16.17±1.47)Hz，给药前后放电频率差异有显著性(P＜0.05)。在微电泳H89的第20 s，再微电泳UCN2(20nA，20 s)，受试的VTA神经元中的52%(10/19)放电频率略降低，由(15.80±2.41)Hz改变为(15.45±1.28)Hz但给药前后差异无显著性(P>0.05)(Fig3A,3B)。
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| Fig 3 Effects of UCN2 on PKA pathway A： Effects of UCN2 (10-6 mol·L-1, 20nA, 20s) and H89 on VTA′s DA neuron.**P＜0.01 vs normal group; ##P＜0.01 vs h89 group;B： Effects of UCN2 on VTA′s dopaminergic neuron spontaneous firing rates via PKA pathway. |
实验中发现，吗啡成瘾大鼠VTA 神经元放电频率明显增加，呈爆发式放电，而神经肽UCN2 能使其神经元放电频率明显减慢，提示UCN2对吗啡成瘾大鼠VTA神经元的放电起抑制作用。研究表明[7]，阿片类药物能直接或间接刺激VTA，产生神经元异常高频放电，VTA是愉悦系统或奖赏系统的重要部分，当产生奖赏行为时，能够刺激VTA神经元兴奋性放电，产生药物依赖成瘾，本实验结果进一步提示，UCN2可以通过抑制VTA神经元异常高频放电，对阿片类药物成瘾起到抑制及治疗作用。
实验中单独微电泳选择性CRF2R阻断剂AST-2B可增加受试VTA神经元的放电频率。微电泳UCN2 期间，其抑制作用可被AST-2B所拮抗，结果提示UCN2 对吗啡成瘾大鼠VTA 神经元的抑制效应可能是通过与CRF2R结合后而产生。UCN有3种形式：UCN1、UCN2、UCN3。CRF 受体主要有CRF-1R、CRF-2R两种 ，新近发现的非哺乳动物CRFR3受体，均为7 次跨膜的G 蛋白偶联受体，CRFR1 受体能高亲和力地与CRF、UCN1 肽结合。而UCN2、UCN3只对CRFR2 受体有特异结合特征。UCN与CRF-R2 结合后，具有抗氧化、抗衰老、抗焦虑、忧郁等多种生理作用及药理功能[8, 9]。有研究表明，Urocortin在脑损伤过程中具有神经保护作用，特别是在药物成瘾、神经退行性疾病中发挥重要调节作用，但目前机制尚不十分明确[10]。因此，本实验结果进一步提示，UCN2在对吗啡类药物成瘾中主要是通过与CRF-R2 结合发挥抑制作用。
实验结果表明，DA能投射纤维对VTA 神经元有兴奋作用，UCN2 可以拮抗DA的兴奋效应，且给予AST 对DA兴奋效应具有一定协同作用，提示UCN2 与VTA 神经元中CRF2 受体结合后，拮抗DA在吗啡成瘾中的兴奋毒性。有报道表明[11]，VTA 中的DA神经元异常兴奋，诱发VTA神经元过度爆发式放电，产生药物依赖性。UCN2是CRF肽类家族的成员，有研究表明，UCN2可增加实验鼠的迷宫探索能力，增强学习和记忆能力，具有抗焦虑作用及很强的镇静效应。UCN2与酒精成瘾有密切关系，微量核团注射UCN2能减少小鼠自我供给酒精的量，在酒精戒断过程中发挥作用。吗啡是通过阿片受体作用于VTA上的DA能神经元，从而引起DA释放增加，减弱或消除GABA能神经元对DA神经元的抑制作用，进一步促进DA释放。因此，本实验结果进一步提示，UCN2能够抑制VAT中DA神经元活动的物质将有望成为减轻吗啡成瘾的有效药物。
UCN2与CRF-2R 结合后是如何引起效应的呢？其保护VTA神经元作用的机制，很可能与阻断了神经递质DA的兴奋毒性作用有关。有限的研究资料也表明：UCN与酒精成瘾有密切关系，微量核团注射UCN能减少小鼠自我供给酒精的量[10]；可卡因戒断引起的长时程增强可被CRFR1和CRFR2受体拮抗剂阻断[11]；在酒精戒断过程中，大鼠杏仁核细胞外CRF明显升高。上述结果均提示：UCN可能通过CRF-R2受体参与酒精成瘾及戒断后焦虑和觅药等行为的应激性反应[12]。另外，VTA的DA能神经元成簇放电导致其突触末梢DA释放量瞬时大量增加，已被公认是编码奖赏效应的功能信号，但诱发DA能神经元产生簇放电的神经机制尚不完全清楚[7]。在本实验中证实，微电泳PKA阻断剂H89后，再给予UCN2，可使VTA中DA神经元的放电频率略降低，但给药前后差异无显著性，该结果提示，UCN2与CRF-2R 结合后，进而通过激活蛋白激酶A引起效应。
本实验结果表明，UCN2 可以通过作用于CRF-2R能够抑制VTA神经元放电活动，降低神经元的过度兴奋性，并且降低DA能兴奋毒性，提示在吗啡成瘾病理情况下，UCN2可以起到神经元保护作用，研究结果为药物成瘾机制提供新的实验依据，对临床防治提供新的思路。
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