骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)来源于骨髓,是具有自我更新及多向分化功能的细胞[1]。BMSCs的成骨分化能力随年龄增加而减弱,并在微重力环境下被抑制,这可能是导致骨质流失的重要原因之一[2, 3, 4]。Wnt/β-catenin信号通路是调控BMSCs成骨分化的重要信号通路[5]。近年来研究表明,多种植物药或天然药物单体能有效防治骨质疏松,如续断、蛇床子素等[6, 7, 8]。黄芩为唇形科植物,富含黄酮类化合物,黄芩苷是其中的主要活性组分(化学结构见Fig1)。在不同结构的36个黄酮类化合物中,黄芩苷对原代成骨细胞碱性磷酸酶活性促进作用最为明显,并且通过上调Wnt/β-catenin信号促进成骨细胞分化[9]。然而,黄芩苷对rBMSC的成骨分化的作用及其分子机制还未见报道。本实验以大鼠rBMSC为对象,研究黄芩苷对细胞增殖及成骨分化和成熟的影响,以及对Wnt/β-catenin信号通路的调控。
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| Fig.1 Chinese Pharmacological Bulletin |
体质量220~250 g的Sprague-Dawley大鼠4只,购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心(动物合格证号:SCXK军2007-007)。DMEM/F12培养液、胎牛血清、青-链霉素及0.25% Trypsin-EDTA购自Thermo Scientific Hyclone公司。黄芩苷(纯度≥99%)、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松、MTT试剂、固蓝RR、茜素红、二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma-Aldrich公司。碱性磷酸酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。总RNA提取试剂盒(离心柱型)、反转录试剂盒、SYBR Green荧光定量预混试剂均购自天根生化科技(北京)有限公司。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计合成。β-catenin、Runx-2单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的二抗购自Abcam公司。
1.2 实验方法 1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养大鼠颈椎脱臼处死,于75%酒精中浸泡10 min,在无菌条件下快速分离股骨及胫骨,切除两端骨骺,用5 mL注射器抽取一定量DMEM/F12培养液冲洗骨髓腔至液体澄清。收集冲洗液,用微量移液器吹打后静置5 min。取上清液,于1 000 r·min-1离心5 min,弃上清,用含10%体积分数胎牛血清的DMEM/F12使细胞重悬,反复吹打后计数,以104个/cm2的密度接种于6孔板中,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。3d后首次换液,每日观察细胞生长情况,待贴壁细胞达80%融合后用胰酶进行消化传代培养(此为第一代P1)。待细胞传代至P3时进行实验,96孔板、24孔板、6孔板接种密度为2×103、2×105、4×105细胞/孔。
1.2.2 ALP活性测定细胞接种于96孔板,培养24h后进行成骨性诱导(诱导培养液中抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松浓度分别为0.284、10、2×10-3mmol·L-1)。同时进行给药处理,系列黄芩苷终浓度为0.1、0.5、1、5、10、50 μmol·L-1,每组设6个复孔。给药组与对照组培养液均含有1‰的DMSO。于37℃、5% CO2培养箱中培养3、5、7d,每3 d换液1次。弃培养液,PBS洗2次,每孔加入缓冲液和基质液各50 μL,混匀于37℃水浴15 min,加入150 μL显影液,于520 nm波长下测吸光度(OD)。根据试剂盒说明配制酚标液标准曲线,根据酚标液及样本的吸光度值计算酶活性,结果以每孔15 min内产生酚的摩尔量表示。
1.2.3 碱性磷酸酶阳性克隆(CFU-FALP)分析细胞接种于12孔板,培养24 h后成骨诱导,给药组给予10 μmol·L-1黄芩苷,对照组加入空白诱导培养基,给药组与对照组培养液均含有1‰的DMSO。7 d后采用偶氮偶合法进行ALP组织化学染色。PBS洗2遍,10%甲醛溶液固定1 min,加入基质液(含0.1%的α-萘基磷酸钠和固蓝RR盐的Michaelis氏巴比妥钠-HCl缓冲液,pH 8.9)中反应30 min。出现褐色斑点时弃掉基质液,PBS洗后固定,照相保存结果,用Image-Pro Plus 6.0软件扫描CFU-FALP的面积、数量和灰度,进行统计学分析。
1.2.4 矿化结节形成细胞接种于24孔板,培养24h后成骨诱导,给药组给予10 μmol·L-1黄芩苷,对照组加入空白诱导培养基,给药组与对照组培养液均含有1‰的DMSO。d12弃培养液,PBS洗2次,10%甲醛固定5 min。加入茜素红染色剂,37℃孵育1 h,观察矿化结节的形成情况。照相保存结果,用Image-Pro Plus 6.0软件扫描矿化结节的面积、数量和灰度,进行统计学分析。
1.2.5 Real time-qPCR分析细胞接种于6孔板,培养24h后成骨诱导,给药组给予10 μmol·L-1黄芩苷,对照组加入空白诱导培养基,给药组与对照组培养液均含有1‰的DMSO。8、24、48h后,按试剂盒方法提取总RNA,用超微量紫外可见分光光度计检测浓度和纯度,调整RNA浓度至1 μg,取1 μL逆转录为cDNA。在体系中加入引物(见Tab1)和SYBR Green试剂,于Bio-Rad CFX96型实时荧光定量PCR仪上,以两步法对cDNA进行扩增。预变性阶段,在95反应10 min,一个循环。PCR反应阶段,分别为95反应15 s、57反应30 s、72反应30 s,共40个循环。记录CT(cycle threshold)值,通过ΔΔCT=(CT目的基因-CT内参基因)处理组-(CT目的基因-CT内参基因)对照组,计算各组2-ΔΔCT,即得该目的基因给药组mRNA表达与对照组mRNA的倍数。
细胞接种于6孔板，培养24 h后成骨诱导，给药组给予1、10 、50 μmol·L-1浓度黄芩苷，对照组加入空白诱导培养基，给药组与对照组培养液均含有1‰的DMSO。处理3 d后，每孔用300 μL细胞裂解液(含有PMSF 1 mmol·L-1)提取总蛋白。用超微量紫外可见分光光度计检测蛋白浓度，加入含有溴酚蓝的上样缓冲液，于95℃变性5 min，经12 %SDS-PAGE电泳分离后，将待测蛋白转移至PVDF膜上，用5 %脱脂奶粉于室温下摇床封闭1 h，加入用TBST稀释的β-catenin、Runx2、β-actin的一抗(稀释比例为1 ∶ 1 000)，4℃过夜。次日用TBST将PVDF膜洗3次后，加入用TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下摇动2 h。洗膜3次后，将发光液涂抹于PVDF膜上，于暗室曝光。将胶片进行拍照，用IPP6.0软件对条带的灰度值进行测定，用相对定量进行分析。
1.2.7 统计学分析测定结果以x±s表示，采用SPSS 16.0软件处理数据，并采用ANOVA分析比较各组之间差异。
2 .结果 2.1 不同浓度黄芩苷对碱性磷酸酶活性的影响如Fig2所示，rBMSC经成骨诱导后，ALP活性随时间而增加，诱导7 d后ALP活性最高。不同浓度黄芩苷在5、7 d均能增加ALP活性(P<0.01)，并呈现出浓度依赖性，其中10 μmol·L-1黄芩苷对ALP活性增加最为明显，而在50 μmol·L-1时ALP活性略有降低。
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| Fig.2 Effect of baicalin on ALP activity at various concentrations(n=6) *P < 0.05,**P < 0.01 vs con |
如Fig3所示,rBMSC经成骨诱导7 d后,对照组与给药组均能形成碱性磷酸酶活性阳性克隆(CFU-FALP)。通过IPP 6.0软件对进行CFU-FALP灰度扫描(Tab2),给予黄芩苷1、10、50 μmol·L-1后,CFU-FALP的面积、数量和相对灰度高于对照组,且两组间差异有统计学意义(P < 005或P < 001)。
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| Fig.3 Effect of baicalin at various concentrations on CFU-FALP formation 7 days after osteogenic induction.A:CON,B:baicalin at 1μmol·L-1;C:baicalin at 10μmol·L-1;D:baicalin at 50 μmol·L-1 |
如Fig4所示，rBMSC经成骨诱导12 d后，对照组与黄芩苷组均形成钙化结节。给予黄芩苷1、10 、50 μmol·L-1后,钙化结节形成数量多于对照组。经IPP6.0软件分析(Tab3),钙化结节的面积尧数量和相对灰度高于对照组,且两组间差异有显著性(P < 0.01)
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| Fig.4 Effect of baicalin at various concentrations on mineralized nodule formation 12 days after osteogenic induction A:CON;B:baicalin at 1 μmol·L-1;C:baicalin at 10 μmol·L-1;D:baicalinat 50 μmol·L-1 |
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经10μmol· L-1黄芩苷处理原代rBM-SC 12/24/36h后，Real time-qPCR检测Wnt/β-catenin信号通路表达的变化，用相对定量法2-ΔΔCT分析检测结果。如Tab4所示，给药组在12、24、36h均可明显提高Wnt10a、GSK-3β、β-catenin、LEF1和osteocalcin的基因表达量(P < 0.05 or P < 0.01)。其中黄芩苷在36 h对Wnt10a以及LEF1mRNA表达水平影响最为明显，与同时间对照组相比，相对于管家基因GAPDH分别提高25.82倍和16.63倍。
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经1、10 、50 μmol·L-1黄芩苷处理原代rBMSC 3 d后，采用Western blot检测β-catenin和Runx2蛋白表达量。结果如Fig5所示，黄芩苷仅在10 μmol·L-1浓度下能明显提高Runx2的蛋白表达量，而黄芩苷在1、10、50 μmol·L-1的给药浓度下均能提高β-catenin的蛋白表达量。
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| Fig.5 Effect of baicalin at various concentrations on protein expression of β-catenin and Runx2 after osteogenic differentiation for 3 days *P < 0.05,**P < 0.01 vs CON |
近年来研究表明，植物药在防治骨质疏松方面具有巨大潜力。在传统中药方剂的基础上开发和改良出多个抗骨质疏松中成药。Wang等[10]总结了12项抗骨质疏松中成药的随机对照试验并评价其有效性，受试者包括1 816名骨质疏松患者。结果表明，受试中药制剂都明显增加了患者腰椎的骨密度。多种黄酮类化合物在细胞或动物水平显示出明显促成骨作用，如淫羊藿苷、染料木黄酮、白藜芦醇、蛇床子素等[10, 11, 12, 13, 14]。与传统治疗骨质疏松药物相比，植物药来源广泛且毒副作用较低，因此具有较大的应用开发价值。
BMSCs源于骨髓，具有自我更新及多向分化功能，在一定条件下能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、 成肌细胞、成软骨细胞、神经细胞等[1]。促进BMSCs 的成骨分化，能够增加骨形成及骨强度。近年来，应 用BMSCs对骨相关疾病进行细胞治疗引起极大关注，BMSCs在骨组织工程中也表现出巨大的应用潜力[15, 16, 17]。本实验结果表明，黄芩苷能够促进BMSCs的成骨分化成熟，明显提高ALP活性、ALP阳性克隆形成、钙化结节形成，并提高Runx2基因及蛋白表达，所测定指标均与细胞成骨分化密切相关。
Wnt/β-catenin信号通路在调控BMSC成骨分化过程中发挥重要作用，但文献报道有正、负调控两种结果。转染Wnt1、Wnt10a、Wnt10b及β-catenin的ST2细胞经成骨诱导后，细胞ALP活性及钙化能力明显提高[5]。整体动物水平，FABP4-Wnt10b转基因小鼠的骨量为野生型小鼠的4倍[18]。GSK-3α/β抑制剂603281-31-8能促进C3H10T1/2细胞的骨向分化[19]。C3H10T1/2细胞转染Wnt3A腺病毒载体后，通过上调CNN1/Cyr61表达增加其骨向分化[20]。然而Wnt3a抑制人BMSC的ALP活性并抑制其矿化[21, 22]。实验结果的不一致可能与采用的细胞类型及Wnt信号分子的水平高低密切相关。除了诱导BMSC分化，Wnt/β-catenin信号的过度激活能诱导BMSC衰老[23]。并且利用转基因小鼠，在骨细胞持续激活β-catenin表达能够明显增加松质骨骨量，但减弱骨力学性能[24]。因此，Wnt/β-catenin信号强弱对调控结果的影响，以及Wnt/β-catenin信号在不同细胞谱系、细胞周期所起的作用值得深入研究。
据报道，黄芩苷促进成骨细胞分化并非通过雌激素信号通路发挥作用，而是通过激活Wnt/β-catenin信号[7]。我们发现黄芩苷能够提高Wnt10a、GSK-3β、β-catenin和LEF1的基因表达，并在蛋白水平提高β-catenin的表达量，表明黄芩苷可能通过调控Wnt/β-catenin信号而促进BMSCs的分化成熟。BMSCs的分化成熟是复杂的过程，在黄芩苷调控rBMSC成骨分化的过程中是否有其他Wnt/β-catenin信号分子或其他信号通路的参与还有待于进一步研究。
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