2. 贵阳医学院民族药与中药开发应用教育部工程研究中心, 贵州 贵阳 550004
2. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Ministry of Education，Guiyang Medical University, Guiyang 550004, China
杜仲为杜仲科杜仲属植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮，其味甘，性温，归肝经、肾经，为国家二级珍稀树种，是传统名贵滋补药材。有补肝肾、强筋骨、安胎等功效，主要用于治疗肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩、妊娠漏血、胎动不安等疾病[1, 2, 3]。
课题组在前期工作中采用Caco-2细胞模型研究杜仲提取物的摄取机制以及不同因素影响下杜仲提取物的摄取特点[2]。本文进一步采用大鼠在体肠循环灌流模型[4] ，以原儿茶酸、松脂醇单葡萄糖苷和松脂醇二葡萄糖苷为考察对象，对杜仲提取物的肠吸收特性进行研究，并探讨其在不同因素影响下的肠吸收动力学特征，为杜仲的物质基础研究提供必要的科学依据。
1 材料 1.1 仪器与试药超高效液相色谱质谱联用仪(美国Waters公司)；ZH-2涡旋混合器(天津药典标准仪器厂)；Allegra 64R高速离心机(美国Beckman Coulter 公司)； MTN-2800D氮吹浓缩装置(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)；EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；HL-2S蠕动泵(上海青浦沪西仪器厂)；DK-98-ⅡA恒温水裕锅(天津泰斯特仪器有限公司)。
葛根素(内标，批号：111-0906623，中国药品生物制品鉴定所)；原儿茶酸(批号：110306，四川省维克奇生物科技有限公司)；松脂醇二葡萄糖苷(批号：201206，上海顺勃生物工程有限公司)；松脂醇单葡萄糖苷(批号：201206，江苏弘惠医药有限公司)；乌拉坦(上海行知化工厂)；盐酸维拉帕米(阿拉丁)；杜仲提取物(自制，批号：20130823)；甲醇、乙腈为色谱纯；Krebs-Ringer’s(K-R)营养液(NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4 0.32 g及MgCl2 0.02 g，加500 mL蒸馏水溶解，0.37 g CaCl2、葡萄糖 1.4 g溶于500 mL蒸馏水，两者混匀即可)。
1.2 动物健康SD大鼠(♀ ♂各半)，体质量200~240 g，由贵阳医学院动物中心提供。批号：SCXK(黔)2014-0003。
2 方法 2.1 色谱条件色谱柱：Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱，流动相：0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度为0~0.5 min：5%~10%(A)，0.5~3.5 min：10%~20%(A)，3.5~4 min：20%~90%(A)，4~5 min：90%~5%(A)；流速：0.30 mL·min-1；柱温：45 ℃；进样体积：1 μL。
2.2 质谱条件电喷雾电离源(ESI)，毛细管电压：3 kV，离子源温度120 ℃ ；喷雾气与反吹气：N2，去溶剂气流速650 L·h-1，温度350 ℃ ；反吹气流速50 L·h-1；扫描方式为多反应离子监测(MRM)。原儿茶酸：m/z(-)152.9→109、松脂醇二葡萄糖苷：m/z(-)681.3→357.2、松脂醇单葡萄糖苷：m/z(-)519.3→357.2及葛根素：m/z(+)417→267。
2.3 供试药液的制备取适量杜仲提取物，加入适量K-R营养液，超声使溶解，10 000 r·min-1离心5 min，取上清液备用，获得2.0、4.0、8.0 mg·L-1的供试液。
2.4 在体肠吸收实验参照文献[5, 6]，本实验据其具体内容并进行适当修改，对大鼠麻醉后固定进行手术，取50 mL肠循环液以5 mL·min-1流速循环 10 min，再以 2.5 mL·min-1的速度继续回流，立即读出循环液体积并取样1 mL，另向量筒中补加K-R 缓冲液1 mL，其后每隔 30 min 亦按同法读数，取样并补加等体积K-R 缓冲液，循环 3 h 后中止。 取肠灌流样品溶液100 μL，加20 μL 20.03 mg·L-1内标溶 液，400 μL甲醇及100 μL 0.1%的甲酸，涡混1 min，15 000 r·min-1离心5 min，取上清液进样UPLC-MS/MS分析。
2.5 统计学分析同参考文献[6]
3 结果 3.1 不同pH值及浓度的考察对3个成分在不同pH条件及不同浓度下累计吸收常数(A)进行方差分析比较，pH=6.0时，各成分的3 h累计吸收量相对较高。原儿茶酸在低浓度时A%明显高于中、高浓度(P<0.05)，松脂醇单葡萄糖苷在中浓度时A%明显低于高浓度(P<0.05)；提示其在体内的吸收机制可能为被动吸收，见Tab1、2。
3种成分在结扎胆管及维拉帕米抑制P-gp条件下的累计吸收常数(A)经方差分析，表明胆汁对3种成分的吸收均具有抑制作用(P<0.05)，加入P-gp抑制剂后原儿茶酸吸收明显增加(P<0.05)，结果见Tab3。
, n=4)
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对3个成分在不同肠段的累计吸收常数(A)进行方差分析，原儿茶酸在空肠的累积吸收量较回肠大 (P<0.05)。3种成分在不同肠段的吸收趋势，原儿茶酸：空肠>回肠> 十二指肠>结肠；松脂醇二葡萄糖苷：回肠>空肠>十二指肠>结肠；松脂醇单葡萄糖苷：十二指肠>回肠>空肠>结肠。见Tab4。
本实验研究表明，原儿茶酸、松脂醇单葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷在小肠均有吸收，胆汁对3种成分的吸收存在抑制作用，原儿茶酸可能是P-gp的底物。3种成分的吸收速率 与药物浓度有一定的关系，3种成分的吸收为一级吸收动力学，提示其吸收机制可能是被动转运过程。
| [1] | 国家药典委员会.中国药典,一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:154. Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. Beijing: China Medical Science Press, 2010.Vol I:154. |
| [2] | 兰燕宇,刘 跃,曹 旭,等.杜仲提取物4种主要成分在Caco-2细胞的摄取特征性研究[J].中国药理学通报,2014,30(9):1306-11. Lan Y Y, Liu Y, Cao X, et al. Uptake of Euconmmia ulmoides extract in Caco-2 cell monolayer[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014,30(9):1306-11. |
| [3] | 彭红梅,李小姝.杜仲的药理研究现状及应用展望[J].中医学报,2013,28(176):72-3. Peng H M, Li X S. Pharmacological research and application of Eucommia ulmoides[J]. China J Chin Med,2013,28(176):72-3. |
| [4] | 王 春,魏 伟,杨昭毅,等.芍药苷微乳溶液在大鼠在体肠的吸收动力学研究[J].中国药理学通报,2009,25(2):181-5. Wang C, Wei W, Yang Z Y, et al. Studies on absorption kinetics of paeoniflorin microemulsion in rats intestines[J]. Chin Pharmacol Bull, 2009,25(2):181-5. |
| [5] | Yu L X, Lipka E, Crison J R, et al. Transport approaches to the biopharmaceutical design of oral drug delivery systems :prediction of intestinal absorption[J].Adv Drug Deliv Rev, 1996,19(3):359-76. |
| [6] | 唐 靖,罗丽娜,张海龙,等.基于procaspase-3激活的抗肿瘤活性分子SM-1吸收机制研究[J].中国药理学通报,2014,30(4):542-6. Tang J, Luo L N, Zhang H L, et al. Absorption mechanism of SM-1: a procaspase-3-activated anti-tumor agent[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014,30(4):542-6. |