溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种反复发作的肠道慢性非特异性炎症性疾病，发病机制尚未明确，细胞因子IL-6及其介导的信号通路在非可控性肠道炎症过程中起关键作用^[1]。导师沈洪教授所拟清肠化湿方(QHR)，治疗轻、中度UC，取得良好效果^[2]。课题组前期研究表明该方能调控UC大鼠NF-κB/COX-2通路、PPAR-γ/NF-κB及Toll通路，减少IL-1β、TNF-α等促炎因子分泌，促进抑炎因子IL-10分泌等。本实验在此基础上，以TNF-α、LPS共刺激诱导HT-29细胞炎症模型，观察清肠化湿方对IL-6及其主要信号转导通路之一JAK2/STAT3的影响，进一步探讨其作用机制。

HT-29，购自中国科学院细胞库。清肠化湿方(黄连、黄芩、煨木香等购自江苏省医药公司，生产批号20121201)。柳氨磺胺吡啶(Sulfasalazine，SASP)、McCoy′s5a培养基、LPS：Sigma公司；胎牛血清(Gibco公司)；Recombinant Human TNF-α(Pepro Tech公司)。人IL-6 ELISA试剂盒(EB公司)；引物由上海生工合成；Real Time PCR试剂盒(TaKaRa公司)；兔抗p-JAK2、p-STAT3单抗(Cell Signaling Technology公司)。酶标仪、电泳仪、转膜仪、Western blot 曝光仪购自美国Bio-Rad公司；Real Time PCR仪(TaKaRa)；UVP凝胶成像系统(UVP公司)。

称取清肠化湿方1付，共87 g，煎煮、蒸发、减压浓缩至27 ml母液，4℃保存。

取指数生长期HT-29细胞，分为6组：对照组：加入不含FBS的McCoy′s 5a孵育24 h；模型组：根据前期研究^[3]，予hTNF-α(20 μg·L^-1)^{[4, 5]}孵育12 h后，再予LPS(1 mg·L^-1)^{[5, 6]}孵育15 h；实验组：根据前期研究^[3]，在上述药物干预的基础上，分别加入SASP(2 mmol·L^-1)、QHR高、中、低剂量(10、1、0.1 mg·L^-1)孵育24 h。

收集细胞上清液，转移至1.5 mL Eppnedorf管，离心机1 600 r·min^-1离心5 min，取上清。按ELISA试剂盒步骤检测IL-6的水平。

取HT-29细胞，TRIzol充分裂解，氯仿萃取，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，溶于DEPC水，-80℃保存。取2μg总 RNA逆转录为cDNA。引物：JAK2：上游5′-GGAATGGCCTGCCTTACAATG-3′；下游5′-TGGCTCTATC TGCTTCACAGAAT-3′；STAT3：上游5′-CACCTTGGATTGAG AGTCAAGAC-3′；下游5′-AGGAATCGGCTATATTGCTGGT-3′；GAPDH：上游5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；下游5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。Real-time PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，DEPC水9.5 μL。反应条件：95℃预变性2 min，95℃ 5 s，57℃ 30 s，扩增45个循环；95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s循环读取溶解曲线，57℃ 30 s读取荧光。结果以CT值表示。

基因表达量以各样基因CT值减去内参基因GAPDH CT值表示，相对表达量以2^-ΔΔCt表示。

取HT-29细胞，低温提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，以30 μg质量体积分数上样，分离胶 SDS-PAGE 分离样品，转膜，封闭。按1 ∶ 1 000浓度稀释一抗，4℃摇床振荡孵育过夜，充分洗涤，按1 ∶ 3 000浓度稀释二抗，室温摇床振荡孵育2 h，充分洗涤，加 ECL 显影液。

实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行t检验、One way-ANOVA分析，计量资料以表示。

模型组细胞上清IL-6水平较对照组明显升高(P<0.01)，QHR各剂量组IL-6的水平较模型组降低(P<0.01)，并呈剂量依赖性，QHR高剂量组与SASP组相比差异无统计学意义。见Tab1。

Tab 1 Effects of QHR on IL-6 secretion from HT-29 cells(，n=3)

表选项

与对照组比较，各组JAK2基因表达差异倍数未见明显差异，各组STAT3基因表达差异倍数未见明显差异。

与对照组相比，模型组p-JAK2表达明显升高(P<0.01)，与模型组相比，各药物组明显降低(P<0.01)，其中QHR各剂量组呈剂量依赖性。与对照组相比，模型组p-STAT3表达明显升高(P<0.01)，与模型组相比，各药物组明显降低(P<0.01)，其中QHR各剂量组呈剂量依赖性。见Tab2。

Tab 2 Effects of QHR on p-JAK2,p-STAT3 protein expression in HT-29 cells(，n=3)

表选项

生理状态下，肠上皮细胞持续暴露于肠道共生菌并能维持稳态，在炎性因子如TNF-α等作用下，肠上皮功能破坏，免疫反应失衡，导致UC发病。研究表明，在遗传易感性IBD动物模型中Th1细胞因子和共生菌为诱导慢性炎症所必须^[6]。由于体外原代培养结肠上皮细胞的困难，目前，主要使用结肠癌细胞株进行研究。Abreu等^[4]研究亦表明，HT-29细胞经TNF-α刺激后可增强对LPS的反应性，LPS信号能激活胞内多条信号通路，促进大量细胞因子和粘附分子等表达，引起瀑布式的炎症级联反应^[7]。本实验以前期研究为基础^[3]，以LPS与TNF-α联合诱导HT-29细胞炎症，结果上清中IL-6水平明显增高，与Jeong等^[5]报道一致。IL-6是一种多向性细胞因子，由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌，能刺激巨噬细胞或单核细胞、淋巴细胞等合成前列腺素、细胞因子、血小板激活因子等炎性介质。IL-6 与受体结合后优先激活JAK和STAT3，STAT3经磷酸化活化入核，调控下游靶基因转录，参与调节炎症。IBD患者及一些动物结肠炎或肠炎模型中，皆观察到升高的IL-6 ^[8]，高水平磷酸化的STAT3与疾病严重程度相关^[9]。本实验表明清肠化湿方能降低LPS与TNF-α诱导的HT-29细胞IL-6的分泌，下调p-JAK2、p-STAT3水平，对JAK2、STAT3 mRNA表达水平无明显影响，表明清肠化湿方能抑制LPS与TNF-α诱导的HT-29细胞JAK2、STAT3的活化。清肠化湿方通过降低IL-6表达，抑制JAK2、STAT3活化，阻断炎症的发展和持续，可能是其治疗UC作用机制之一。