2. 河南大学 淮河临床学院, 河南 开封 475004;
3. 河南大学 药学院, 河南 开封 475004
2. Huaihe Clinical College, Henan University, Kaifeng Henan 475004, China;
3. College of Pharmacy, Henan University, Kaifeng Henan 475004, China
氟喹诺酮羧酸是一类广泛应用于临床的化学合成抗菌药物，作用靶点是细菌的DNA回旋酶(gyrase)，抑制细菌增殖[1]。真核生物的拓扑异构酶Ⅱα和Ⅱβ的一级结构序列与细菌的回旋酶非常相似，其中拓扑异构酶ⅡN端结构域(1- 670 氨基酸)与DNA回旋酶的B亚基(GyrB)具有同源性。拓扑异构酶Ⅱ的中部结构域(671-1200氨基酸)与DNA回旋酶的A亚基(GyrA)具有同源性，结构中包含的酪氨酸活性位点对催化DNA断裂和再连接十分必要[2]。目前，已有多种临床应用抗肿瘤药物的作用靶酶是拓扑异构酶Ⅱ[3]。部分抗菌氟喹诺酮羧酸对真核细胞增殖有较弱的抑制作用，例如环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星等[4]。课题组的前期研究结果显示，将氟喹诺酮羧酸的 C-3 羧基与酰腙类化合物结合所合成的新型氟喹诺酮衍生物对拓扑异构酶Ⅱ具有较强的抑制作用[5, 6]，促进拓扑异构酶Ⅱ介导的PBR332质粒DNA解旋和断裂，抑制DNA再连接反应，作用与临床应用的拓扑异构酶Ⅱ毒剂依托泊苷一致[7, 8]。本研究以左氧氟沙星为先导化合物，用12种结构单元替代左氧氟沙星分子结构的C-3羧基，合成一系列左氧氟沙星C-3酰腙衍生物。其中苯甲醛左氧氟沙星席夫碱(S)-1,8-(2-甲基亚乙氧基)-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-[S-苄基硫基-4-(对硝基苯甲叉基氨基)-1,2,4-均三唑-3-基]-喹啉(1-H)-4-酮(M18，Fig1)活性最强，IC50值达8.65 μmol·L-1，具有进一步研究开发的价值。
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| Fig 1 Structure of(S)-1, 8-(2-methyl phosphate ethoxy)-6-fluorine-7-(4-methyl-piperazine-1-base)-3-［S-benzyl s-based-4-(for nitrobenzene methylene group amino)-1,2,4-all triazole-3-base］-quinoline (1-H)-4-ketone |
苯甲醛左氧氟沙星席夫碱由河南大学化学生物学研究所设计、 改造并合成，HPLC 法测定纯度>99%，溶解在二甲基亚砜(DMSO，Solarbio公司)中，浓度为1×10-2 mol·L-1。
1.1.2 细胞株和主要试剂人肝癌细胞系SMMC-7721和 HEPG-2、人乳腺癌细胞MB-231、人结肠癌细胞HCT-116购自中国医学科学院基础医学研究所，生长在含体积分数为0.1的胎牛血清( 杭州四季青生物工程材料有限公司) 的DMEM 培养基(Gibco 公司)中，置体积分数为0.05 的CO2、37℃恒温培养。 四甲基偶氮唑盐(MTT)，DeadEndTM Fluorometric TUNEL System(Promega 公司)； 线粒体分离试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；caspase-3、p53、细胞色素C抗体(Cell Signaling Technology)；β-actin 抗体、HRP 标记的羊抗兔IgG、HRP 标记的羊抗鼠IgG( 中杉金桥公司)；Hoechst 33258 (Sigma 公司)。其余试剂为国产分析纯产品。
1.1.3 主要仪器二氧化碳培养箱(Thermo Forma，3121，USA)；酶标仪(Thermo Multiskan Ascent，USA)； BX51荧光显微镜(Olympus公司)；DYY-7C型转移电泳仪、垂直电泳仪、半干式电转装置、凝胶成像系统(北京六一仪器厂)；高内涵活细胞成像系统(Thermo Fisher Scientific，USA)。
1.2 方法 1.2.1 MTT 法测定药物对细胞增殖的影响细胞以16×107·L-1浓度接种于96 孔细胞培养板，加入不同浓度的M18，分别培养24、48、72 h 后吸去培养液，每孔加入DMSO 0.15 ml 振荡10 min，至蓝色结晶完全溶解，酶标仪测570 nm 吸收度(A) 值并计算抑制率。以含等体积的培养液和DMSO的无细胞孔测的吸光度值为空白对照。根据中效方程式[fa /fu = (D/Dm) m]计算出中效浓度(IC50)[9]。
细胞生长抑制率/% =[1 -(处理组吸收度-空白对照组吸收度) /(对照组吸收度-空白对照组吸收度)]× 100%。
1.2.2 骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养法取C57BL/6J小鼠两只，6~8周龄。在无菌条件下迅速取出双下肢骨，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔，再用4号针头吹打细胞制成单细胞悬液，按照600×107·L-1到800×107·L-1的密度接种至培养瓶中，培养48 h后，每3天更换培养液，细胞密度达80%后传代培养。
1.2.3 Hoechst 33258 染色法观察细胞凋亡形态变化细胞以1×108·L-1浓度接种于放置盖玻片的6孔板，待细胞贴壁后，加入不同浓度的M18培养24 h，PBS洗2次，多聚甲醛固定15 min，30 μL Hoechst 33258工作液于盖玻片上，室温染色10 min。PBS漂洗2次，中性甘油封片，荧光显微镜下观察并记录。
1.2.4 TUNEL 法测定细胞凋亡率取1×108·L-1 细胞数接种细胞于放置盖玻片的6孔板，用不同浓度的M18作用24 h，按Promega 公司的试剂盒说明书操作，检测细胞凋亡率。
1.2.5 线粒体膜电位(△ψm) 测定以8×107·L-1的浓度接种细胞到6孔板，用不同浓度的M18培养24 h，每孔加入1 mL的Rh-123稀释液1 h，PBS 洗3遍，加入终浓度为5 mg·L-1的Hoechst 33342避光染色10 min，PBS 洗涤，高内涵活细胞成像系统观察分析。
1.2.6 线粒体蛋白的分离常规收集经不同浓度M18作用24 h的细胞，12 000 r·min-1离心10 min，PBS洗涤，按照细胞线粒体分离试剂盒说明书提取细胞线粒体蛋白与胞质蛋白。
1.2.7 Western blot 检测蛋白表达不同浓度M18 作用细胞24 h，RIPA 裂解液200 μL充分裂解细胞，4℃离心( 12 000 r·min-1) 5 min 提取蛋白，考马斯亮蓝G250 法分光光度计测样品蛋白浓度，12% SDS-PAGE 电泳分离。电转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗(1 ∶ 2 000) 4℃封闭过夜，二抗(HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠抗体1 ∶ 4 000) 孵育1 h，化学发光法显示结果，凝胶图像分析系统拍照。
1.3 统计学分析所有资料均采用 SPSS 14.0软件包进行统计学处理。计量资料用
表示，组间比较采用t检验分析。
不同浓度的M18 分别作用于SMMC-7721、MB-231、HCT-116和HEPG-2细胞24、48和72 h，M18对肿瘤细胞有较强增殖抑制作用，并呈时间与浓度依赖关系，24 h的IC50 值分别是8.65 μmol·L-1(r2=0.8841)、9.37 μmol·L-1(r2=0.8523)、12.74 μmol·L-1(r2=0.7994)和9.40 μmol·L-1(r2=0.8218)；M18 分别作用于骨髓间充质干细胞24、48和72 h，对细胞的增殖抑制作用不明显，24 h的IC50值为38.96 μmol·L-1(r2=0.7822)；M18合成原料左氧氟沙星对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖的影响不明显，24 h 的IC50值为 735.10 μmol·L-1(r2 = 0.6854)(Fig2)。
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| Fig 2 Proliferation inhibition effect of M18 and levofloxacin on human cancer cells and BMSCs SMMC-7721 cells (A), MB-231 cells (B), HCT-116 cells (C), HEPG-2 cells (D) and BMSCs (E) were treated with various concentrations of M18 for 24-72h. SMMC-7721 cells were treated with concentrations of levofloxacin (F) for 24~72 h. |
Hoechst 33258染色结果显示，M18 作用于SMMC-7721 细胞24 h，出现细胞膜皱缩、染色质凝集、核呈碎片状等凋亡形态学变化(Fig3)。TUNEL 结果显示，随着M18 浓度增加，凋亡细胞明显增多，呈浓度依赖性(Fig4，Tab1)。
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| Fig 3 SMMC-7721 cell apoptosis under fluorescent microscope stained by Hoechst 33258 (×200) A: Control; B: M18(2.467 μmol·L-1); C: M18(8.650 μmol·L-1); D: M18(26.401μmol·L-1) |
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| Fig 4 Induction of apoptosis of SMMC-7721 cells treated with M18 for 24 h evaluated by TUNEL assay Representative images were taken，nuclear stain(DAPI，A) and apoptotic stain (TUNEL，B) overlaid. 1: Control; 2: M18(2.467 μmol·L-1);3: M18 (8.650 μmol·L-1); 4: M18 (26.401 μmol·L-1).Magnification，200× |
Rh-123荧光强度可以间接反映线粒体膜的破坏程度。M18作用于SMMC-7721细胞24 h，随着化合物浓度增加，荧光强度逐渐增大，表明细胞线粒体膜电位降低，与对照组比较，分别降低(8.97±4.15)%、(31.82±5.29)%、(47.25±6.03)%，差异有统计学意义(P<0.01)，见Fig5。
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| Fig 5 Changes in MMP of SMMC-7721 cells induced by M18 for 24 h and analyzed by HCS after staining with Rh-123 A: Control; B: M18(2.467 μmol·L-1);C: M18 (8.650 μmol·L-1); D: M18(26.401μmol·L-1) |
以2.467、8.650、26.401 μmol·L-1 M18分别作用于SMMC-7721 细胞24 h，Western blot 法检测p53、caspase-3的表达和细胞色素C线粒体内外分布。与对照组相比，M18 作用后细胞p53 蛋白表达明显增加，呈明显的浓度依赖关系，caspase-3蛋白表达量增多，活性片段增多。细胞线粒体内细胞色素C分布降低，细胞质内细胞色素C分布增多，提示M18 诱导SMMC-7721 细胞凋亡作用可能与线粒体凋亡通路有关，见Fig6。
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| Fig 6 Effects of M18 on caspase-3, p53 protein expressions and release of cytochrome C from mitochondria to cytosol in SMMC-7721 cells 1: Control; 2: M18(2.467 μmol·L-1); 3: M18 (8.650 μmol·L-1) ; 4: M18(26.401 μmol·L-1) |
部分临床常用的氟喹诺酮类抗菌药物对真核细胞的拓扑异构酶Ⅱ有较弱的抑制作用[10]。研究发现，氟喹诺酮羧酸C-3位羧基对抗菌活性必需，对抗肿瘤活性并非必要，为寻找新型抗肿瘤氟喹诺酮候选物提供思路[11, 12]。本课题组以左氧氟沙星为底物，用结构单位替代C-3位羧基，合成12种左氧氟沙星衍生物，用MTT法检测12种喹诺酮类衍生物对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用，多数化合物显 示出对SMMC-7721细胞的不同程度生长抑制作用IC50值在50 μmol·L-1以下，其中M18对细胞的增殖抑制作用效果最好，24h的IC50值达8.65 μmol·L-1，其合成原料左氧氟沙星对SMMC-7721细胞增殖的影响不明显，IC50值达735.10 μmol·L-1，说明化合物改造符合理论推测，具有较好的研究开发价值。为了解M18对各种肿瘤组织作用的差异，本研究选用4种不同类型的肿瘤细胞株(结肠癌HTC-116细胞、乳腺癌MB-231细胞、人肝癌HEPG-2细胞、人肝癌SMMC-7721细胞)，检测M18对细胞的生长抑制作用。结果证明，M18对多种肿瘤细胞均有明显增殖抑制作用，并呈时间与浓度依赖性。本研究同时应用原代培养骨髓间充质干细胞，检测M18的细胞生长抑制作用，IC50值为38.96 μmol·L-1，明显高于M18对SMMC-7721细胞作用的IC50值。说明M18对肿瘤细胞具有较好的选择性，在未来临床应用中可能具有较小的毒副作用。
本课题组前期实验已经证明，经C-3羧基改造的氟喹诺酮衍生物的作用靶点是DNA拓扑异构酶Ⅱ，造成肿瘤细胞的DNA损伤，这种作用可能激活p53蛋白，诱导细胞凋亡[13, 14]。本实验应用Western blot法检测p53表达量的改变，提示M18杀伤SMMC-7721细胞的作用可能通过DNA损伤，p53增加，进而诱导细胞进入凋亡途径。应用Hoechst 33258荧光染色法观察SMMC-7721细胞核形态变化，观察到M18作用24h凋亡SMMC-7721细胞增加，表现为细胞核染色质凝集、核边移、核碎裂，出现凋亡小体等凋亡细胞核形态学改变。TUNEL法显示，随着M18浓度增加，细胞凋亡率明显升高。Western blot结果也证明，随着M18浓度的增加，caspase-3表达量增多，裂解片段增加。说明通过激活caspase-3途径诱导细胞凋亡[15]。从理论上推测，p53介导的凋亡通路以线粒体凋亡通路为主。本研究用M18导致SMMC-7721细胞线粒体内细胞色素C流出，线粒体膜电位下降，说明M18诱导细胞凋亡主要通过线粒体凋亡通路进行。
综上所述，经改造后的氟喹诺酮衍生物M18明显抑制肿瘤细胞的增殖，并有较好的选择抑制作用，M18诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡，此作用与线粒体凋亡通路有关。
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