组织器官在缺血后进行血液再灌注时可能导致缺血/再灌注损伤的发生。缺血缺氧可导致细胞膜通透性增加、线粒体及溶酶体损伤。再灌注时期由于氧自由基大量释放、细胞内钙超载、炎症细胞浸润等多种因素作用，可引起细胞代谢和功能障碍，发生形态和结构改变，甚至导致细胞死亡。内质网(ER)应激是启动细胞凋亡的重要途径之一，研究表明ER应激参与了心、脑、肾等重要器官缺血再灌注损伤的病理生理过程^{[1, 2, 3]}。中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)在ER应激时特异的表达上调^[4]，在脑缺血、糖尿病、缺血性心脏病等多种病理状态下发挥保护作用^{[5, 6, 7, 8, 9]}，但MANF的保护作用机制尚不十分明确。本研究发现，MANF蛋白可明显改善OGD/R诱导损伤的SH-SY5Y细胞状态，并对ER应激相关蛋白的改变有抑制作用，尤其是减少促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表达。本研究将为理解MANF在缺血/再灌注损伤中的保护作用提供实验依据。

SH-SY5Y细胞为本实验室保存。高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。甲基偶氮唑盐(MTT)、DAPI、PI染料购自美国Sigma公司。ECL底物发光试剂盒购自美国Thermo公司。CHOP/GADD153抗体购自美国Santa Cruz 生物公司，MANF、GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、cleaved caspase-3抗体购自美国Abcam公司，α-tubulin抗体购自美国Sigma公司。重组人MANF蛋白由本实验室自备。Galaxy 170R三气培养箱购自德国Eppendorf公司，荧光倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司，Synergy HT型多功能酶标仪购自美国BioTek公司。

SH-SY5Y细胞培养于含10%胎牛血清，100 kU·L^-1青霉素及100 mg·L^-1链霉素的DMEM培养基中，置于5% CO₂，37℃培养箱，隔日换液1次，3~4 d传代1次。

收集对数生长期SH-SY5Y细胞，分为NC组和OGD/R组。待细胞贴壁后OGD/R组在糖氧剥夺期更换为预热的无葡萄糖平衡盐溶液(a glucose-free Earle’s balanced salt solution，BSS)：NaCl 116 mmol·L^-1,KCl 5.4 mmol·L^-1,MgSO₄·7H₂O 0.8 mmol·L^-1,NaH₂PO₄·2H₂O 1 mmol·L^-1,NaHCO₃ 26.2 mmol·L^-1,Glycine 0.01 mmol·L^-1,CaCl₂·2H₂O 1.8 mmol·L^-1,pH 7.4，放入含1% O₂，5% CO₂，94% N₂，37℃饱和温湿三气培养箱中，初以5 L·min^-1，30 min后培养箱内O₂浓度降至1%，持续充入缺氧混合气体，维持培养箱内O₂浓度低于1%，并开始计时，进行糖氧剥夺6 h。之后两组细胞分别更换为含有2 μmol·L^-1重组人MANF蛋白的DMEM培养基，在5% CO₂，37℃，饱和湿度培养箱中再灌注12 h。使用倒置显微镜观察细胞的形态，并检测细胞存活率及死亡率，以及ER应激相关蛋白和促凋亡相关蛋白的表达。

接种于96孔板的SH-SY5Y细胞，在OGD/R处理结束后加入5 g·L^-1 MTT溶液10 μL(终浓度为0.5 g·L^-1)作用4 h。之后加入150 μL DMSO溶液，使结晶物甲臜溶解，室温震荡10 min，使用酶联免疫检测仪，测量吸光度(optical density,OD)570 nm处各孔的吸光值。各组细胞存活率/%=(该组OD值均值-空白对照OD值均值) / (NC组OD值均值-空白对照OD值均值)×100%。

SH-SY5Y细胞培养于24孔板内，预先加入含有5 mg·L^-1 DPAI的DMEM培养基过夜培养，衬染细胞核，避光操作。待OGD/R处理结束后，各孔加入50 mg·L^-1 PI染料2 μL，室温孵育5 min，轻混匀后在荧光倒置显微镜下观察，细胞核为蓝色荧光，死亡细胞核为红色荧光。随机选取5个视野(100×)，Image-Pro Plus软件计算各视野细胞数，计算细胞死亡率。

SH-SY5Y细胞接种于6孔板，OGD/R处理结束后，使用RIPA裂解液(Tris，pH 7.4；150 mmol·L^-1 NaCl，1% NP-40，0.25% sodium deoxycholate)提取细胞总蛋白，煮沸变性后，用15% SDS-PAGE凝胶分离，转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入适当稀释度的一抗，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，PBS-Triton洗涤后ECL化学发光显色，Adobe Photoshop CS5 Extended软件计算灰度值并进行统计学分析。

采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以表示，组间数据的显著性检验采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。

光镜下可见NC组SH-SY5Y细胞呈单层贴壁生长，多有突起(Fig1 A1)。OGD/R组细胞体积变小，突触变短或消失(Fig1 A2)，MANF明显改善该细胞的状态(Fig1 A3)。MTT 结果显示，OGD/R组SH-SY5Y细胞增殖能力下降，明显低于NC组(P<0.01)，OGD+MANF组细胞增殖活性明显高于OGD/R组(P<0.05) (Fig1B)。该结果表明重组人MANF蛋白对OGD/R诱导的细胞损伤有抑制作用。

Fig 1 Recombinant human MANF inhibits the decrease of OGD / R-induced cell proliferation A: SH-SY5Y cell morphology was observed under an optical microscope, A1: NC group, A2: OGD/R group, A3: OGD/R+MANF group. The cells exposed to OGD/R became smaller and round, and the neurites of the cells were shortened or disappeared. Scale bar=50 μm。B: MTT results revealed that the cell survival rate decreased to (63.86±0.11) % in OGD/R-treated cells, recombinant human MANF protein promoted the cell viability of SH-SY5Y cells. **P<0.01 vs untreated controls; ##P<0.05 vs OGD/R treated group.

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PI染色可见NC组及NC+MANF组仅有少量PI染色阳性细胞(Fig2 A2,A5)，而OGD/R组PI染色阳性细胞明显多于NC组(P<0.01)(Fig2 A8)。OGD/R+MANF组较OGD/R组死亡细胞数明显减少，死亡率下降 (P<0.05)(Fig2 A11)。该结果表明，重组人MANF蛋白能抑制OGD/R诱导的细胞死亡。

Fig 2 Recombinant human MANF inhibits OGD / R-induced cell death A: PI staining was performed to detect the number of dead cells. A1-3: NC group, A4-6: NC+MANF group, A7-9: OGD/R group; A10-12: OGD/R+MANF group. PI stained positive cells showed red (A2, 5, 8, 11), the nuclei were stained with DAPI (blue, A1, 4, 7, 10). Scale bar = 50 μm. B: The quantitative analysis of the PI-positive cells. **P<0.01 vs untreated control group. #P<0.05 vs OGD/R treated group.

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用免疫印迹方法检测ER应激相关蛋白时发现，OGD/R组SH-SY5Y细胞ER应激相关蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、MANF的表达均明显高于NC组(P<0.01)(Fig3)，提示OGD/R可诱导SH-SY5Y细胞发生ER应激。给予重组人MANF蛋白处理后，由OGD/R 上调的GRP78/BiP和CHOP的表达量均有所降低(Fig4)。

Fig 3 Protein levels of endogenous MANF, ER stress-associated proteins, and apoptosis-associated proteins(performed by Western blot) A: Western blotting assay showed that endoplasmic reticulum (ER) stress-associated proteins GRP78/BiP, p-IRE1, p-eIF2α, and MANF were increased significantly after OGD/R treatment, compared with the untreated controls. Meanwhile, OGD/R treatment increased the levels of apoptosis-associated proteins CHOP and cleaved caspase - 3; B: Quantitative data from A were shown as the . **P<0.01 vs the untreated controls.

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Fig 4 Recombinant human MANF inhibits the expression of ER stress associated proteins and pro-apoptotic protein induced by OGD/R A: Western blot was performed to determine the protein levels; B: Quantitation of proteins normalized to tubulin levels (bottom). **P<0.01 vs the untreated control. #P<0.05 vs OGD/R treated group.

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在检测ER应激相关蛋白时发现，OGD/R组促凋亡蛋白CHOP表达增加，该结果提示OGD/R可能诱导了凋亡性的ER应激。为了进一步验证该结果，我们对caspase-3进行了检测，结果发现，与NC组比较，激活性的caspase-3水平也明显增加(P<0.01)。这些结果提示OGD/R可诱导凋亡性ER应激(Fig3)。同时发现，给予重组人MANF蛋白干预后，由OGD/R上调的CHOP和cleaved caspase-3的水平被抑制(P<0.05)(Fig4)。

现已证实，心、脑、肝、肾及胃肠道等多种组织器 官都存在缺血/再灌注损伤的现象。缺血/再灌注的发生机制尚未阐明，目前认为自由基的作用、细胞内钙超载和白细胞的激活是缺血/再灌注损伤的主要发病环节。近年来的研究表明，ER应激在缺血/再灌注导致的细胞凋亡中具有重要作用^{[1, 2, 10]}。

ER应激是启动凋亡的主要途径之一。ER应激触发了一个复杂的信号网络和细胞内非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)过程。UPR主要通过3种跨膜效应蛋白(PERK、IRE1和ATF6)的活化，调节蛋白质的合成、修饰及降解，维持ER内环境稳定，促进细胞存活。在生理状态下，PERK、IRE1和ATF6与GRP78/BiP结合而处于抑制状态。发生ER应激时，PERK、IRE1和ATF6与GRP78/BiP解离，GRP78/BiP与未折叠或错误折叠的蛋白质结合，以促进蛋白质正确折叠，同时PERK、IRE1和ATF6被激活^[11]。PERK激活后催化其底物eIF2α发生磷酸化，使蛋白质合成暂停。IRE1α具有激酶和核糖核酸内切酶活性，可对XBP1进行剪切，生产XBP1的活性形式XBP1s，XBP1s促进蛋白质正确折叠后由ER输出，并加强错误折叠及未折叠蛋白的降解，维持ER的稳态^[12]。本研究发现，OGD/R可上调ER应激标志蛋白GRP78/BiP的表达及激活UPR通路效应蛋白IRE1和PERK，提示 OGD/R可诱导ER应激，导致PERK/eIF2α和IRE1/ XBP1s通路激活，模拟体外缺氧缺血诱导的SH-SY5Y细胞损伤过程。

ER应激是机体应对损伤的一种保护性的反应，故称为适应性ER应激。但当刺激因素过强，或ER应激持续存在而超过机体的代偿能力，则ER应激变得不可逆，从而出现凋亡性ER应激。CHOP是ER应激特异的转录因子，属于转录因子家族成员^[13]，PERK、ATF6以及IRE1都能诱导CHOP的转录。在正常情况下 CHOP 主要存在于细胞质中，含量很低，细胞处于应激状态时，CHOP的表达量大大增加并聚集在细胞核内，过量表达的CHOP 能促进细胞凋亡^[14]。caspase-3是凋亡的关键蛋白，caspase-3经剪切后成为活化型caspase-3(cleaved caspase-3)，水解其蛋白底物，导致细胞凋亡。本研究发现OGD/R可上调CHOP 和cleaved caspase-3的水平，提示OGD/R在凋亡性的ER应激中发挥重要作用。

MANF是神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)家族成员，是1种分泌蛋白，在ER应激时特异性的表达上调，分子伴侣GRP78/BiP与MANF相互作用，并能调节MANF的分泌^[1]。近年来的一些研究结果显示，MANF作为1个新型的神经保护因子，可进入细胞内与凋亡相关蛋白结合发挥细胞保护作用^[5]。MANF包括两个结构域：氨基末端的鞘脂激活蛋白样结构域，可与脂质膜相互作用，其羧基末端结构域可能具有保护细胞应对ER应激的作用。越来越多的证据表明MANF是1个ER应激反应蛋白，在体外实验中MANF能够保护细胞应对ER应激反应诱导的细胞死亡^[4]。晶体结构表明MANF可以帮助蛋白质在ER内折叠。MANF的C-末端结构域，模体¹²⁷CKGC¹³⁰有两个半胱氨酸形成，一个C-末端二硫键可能有助于形成半胱氨酸桥并帮助蛋白质折叠，从而减少未折叠或错误折叠的蛋白质引起的ER应激^[15]。本研究探讨MANF对OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。研究结果表明，再灌注时期给予MANF处理能够抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞的细胞活力下降，减少OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞死亡率增加，表明MANF能够减轻OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤。此外，Western blot显示，经MANF蛋白处理之后，OGD/R诱导的ER应激标志物GRP78增加能够被MANF明显抑制，并且MANF能够减少ER应激特异的促凋亡蛋白CHOP和凋亡执行分子cleaved caspase-3的表达，表明MANF通过抑制SH-SY5Y细胞ER应激抑制凋亡。因此，MANF在SH-SY5Y细胞应对ER应激诱导的损伤中起着重要的作用。本研究为理解低氧诱导的损伤机制以及MANF在缺血/再灌注损伤中的保护作用提供了实验依据。