2. 山西医科大学第一医院内分泌科,山西 太原 030001
2. Dept of Endocrinology of the First Hospital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
我国糖尿病的发病率近年来呈现快速增长的趋势。2型糖尿病以胰岛素分泌相对不足和胰岛素抵抗为主要特征，因此，促进胰岛素分泌是临床治疗2型糖尿病的重要手段。染料木黄酮(genistein)主要来源于豆类植物，大量证据表明染料木黄酮对糖尿病、慢性缺氧、骨质疏松等有一定的预防和治疗作用[1, 2, 3]。研究显示，染料木黄酮可改善2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗[1]，但其对胰岛素分泌的作用及机制尚不明晰。本研究采用放免法测定胰岛素分泌，膜片钳测定胰岛β细胞钾离子通道电流等方法，观察染料木黄酮对大鼠胰岛素分泌的影响，并探讨其作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料胰岛由180~250 g Wistar大鼠分离所得。胎牛血清、高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司；胶原酶P、Histopaque 1077、染料木黄酮、青链霉素及多聚赖氨酸购自美国Sigma公司；Fura 2 AM购自日本同仁(Dojindo)公司；分离胰岛细胞用Dispase酶购自美国Amresco公司；大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术公司。
1.2 方法 1.2.1 胰岛细胞分离及培养根据我们之前报道的方法[4]，分离大鼠胆总管后，经胆总管向胰腺内注入胶原酶P后37℃水浴消化，Histopaque 1077梯度离心，收集消化后的胰腺组织，于体视显微镜下手工挑取胰岛。部分胰岛经dispase酶37℃继续消化6 min，获得胰岛细胞。
1.2.2 胰岛素释放实验根据我们之前报道的方法[4]，配制KRBH孵育液，依实验要求分别添加不同浓度的葡萄糖和染料木黄酮。每个含KRBH的孵育管中放入5个胰岛，置于培养箱中孵育60 min，收集上清液，用放免法测胰岛素含量。
1.2.3 膜片钳实验当细胞封接电阻大于1 GΩ，行全细胞膜片钳记录。将细胞钳制在-70 mV，给予70 mV的电压刺激，记录电压依赖性钾通道(KV)电流。
1.3 统计学处理数据以
表示，用SPSS 17.0 软件分析，采用t检验。
在15 mmol·L-1葡萄糖浓度条件下给予不同浓度的染料木黄酮，结果表明随着药物剂量的增加，胰岛素分泌量逐渐增大。同对照组(control) 相比,10~100 μmol·L-1的染料木黄酮均明显增加了胰岛素的分泌量。见Tab1。
在不同葡萄糖浓度(0、10、15 mmol·L-1)条件下给予100 μmol·L-1 的染料木黄酮，并设平行对照组不给予染料木黄酮，结果显示随着葡萄糖浓度的增加，染料木黄酮的促胰岛素分泌作用逐渐增强。与其平行对照组相比,高糖(10、15 mmol·L-1)条件下染料木黄酮对胰岛素分泌的促进作用差异具有统计学意义，而在无糖环境下染料木黄酮则对胰岛素分泌不产生影响。表明染料木黄酮的刺激胰岛素分泌作用具有葡萄糖浓度依赖性。见Tab2。
在15 mmol·L-1葡萄糖浓度条件下，观察染料木黄酮(100 μmol·L-1)在含不同钙浓度(0、2.5 mmol·L-1)孵育液中对胰岛素分泌的作用。结果显示，同对照组相比，在有细胞外钙离子的条件下染料木黄酮明显促进了胰岛素的分泌；而在无细胞外钙离子条件下染料木黄酮对胰岛素分泌无明显影响。表明染料木黄酮的促胰岛素分泌作用依赖于细胞外钙离子。见Tab3。
结果显示,与给药前(before treatment)相比，给予染料木黄酮干预 (treatment with genistein)使Kv电流明显被抑制；而当去除染料木黄酮干预后(after treatment) Kv电流又恢复至给药前水平。表明染料木黄酮能可逆性地抑制Kv通道电流。见Tab4。
染料木黄酮是一种异黄酮类化合物,主要来源于豆类植物。在对人和动物的研究中发现染料木黄酮具有抗糖尿病作用[5, 6]，这可能与染料木黄酮改善胰岛素抵抗、改善糖脂代谢有关[1]。然而，染料木黄酮是否具有调节胰岛素分泌的作用尚不清楚。在本研究中，我们发现染料木黄酮可以浓度依赖性的促进胰岛素分泌，并且此作用与胰岛所处的葡萄糖浓度环境密切相关，在高糖环境下染料木黄酮的促胰岛素分泌作用更强。
我们的研究进一步发现，染料木黄酮具有明显的抑制胰岛β细胞Kv通道的作用。Jacobson等[7]的研究表明，抑制β细胞Kv通道可以通过延长细胞动作电位时程，进而增加细胞外钙进入细胞内而发挥促进胰岛素分泌作用。我们的实验结果也表明,当去除胰岛β细胞外钙离子后，染料木黄酮的促胰岛素分泌作用基本消失，表明染料木黄酮的促胰岛素分泌作用依赖于细胞外钙离子。此外,我们的前期研究也表明，一种腺苷酸环化酶抑制剂MDL-12330A具有阻断β细胞Kv通道的作用，并且可以葡萄糖依赖性的促进胰岛素分泌[4]，其作用特点与染料木黄酮的促胰岛素分泌作用非常相似。综上所述，我们认为染料木黄酮的促胰岛素分泌作用是其产生抗糖尿病作用的重要因素之一，其作用机制与阻断Kv通道，进而促进钙离子内流有关。
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