2. 新疆医科大学药理教研室, 新疆 乌鲁木齐 830000;
3. 新疆医科大学药物分析教研室, 新疆 乌鲁木齐 830000
2. Dept of Pharmacology, Xingjiang Medical University, Urumqi 830000, China;
3. Dept of Pharmaceutical Analysis, Xingjiang Medical University, Urumqi 830000, China
消化性溃疡(PU)是发生在胃和十二指肠的慢性溃疡，是消化系统的常见病、多发病[1],目前以攻击因子[2](主要指胃酸、胃蛋白酶)与防御因子[3, 4, 5, 6, 7] (主要包括胃黏膜血流量、碳酸氢盐和黏液的分泌、细胞膜完整性、细胞再生以及前列腺素生成等)失衡为主[8]。石榴(Punica granatum L.)别名安石榴、甘石榴等,是石榴科石榴属的落叶灌木或小乔木[9]。我国引入栽培后，各省都有分布，其中，新疆石榴的栽培面积和产量均居全国第一，是新疆和田、喀什等产地特色果品。其果皮、籽、花均可入药，以石榴皮的药用最为显著。近年的药理学研究表明，石榴皮具有抗氧化[10]、抗炎、广谱抗菌、抗病毒[11]、抗癌[12]、降血糖[13]、降脂、预防动脉粥样硬化[14]、保护心血管系统[15]、保护消化性溃疡[16]、降低神经退化、免疫调节、改善肾功能[17]、抗腹泻等药理作用。研究证明，石榴皮提取物对多种原因引起的消化系统有保护作用，如石榴皮提取物对大鼠阿司匹林和酒精引发的胃溃疡有保护作用[18]。石榴皮多酚有效部位以安石榴苷、鞣花酸、没食子酸为主要成分。本实验以中试制备的石榴皮多酚有效部位为供试物，观察其对小鼠的单次给药毒性及对无水乙醇致大鼠胃溃疡的保护作用，为其进一步的临床开发应用提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物昆明种小鼠，SPF级，♀♂各半，体质量20~22 g，由新疆医科大学实验动物中心提供,合格证号：SCXK(新)2003-0001。Wistar 大鼠，SPF级，♀♂各半，体质量180~220 g,由新疆医科大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK(新)2011-0004。
1.1.2 药物与试剂石榴皮(采集于新疆喀什市疏附县伯什克然木乡、阿瓦提乡)；石榴皮多酚有效部位(新疆医科大学药剂教研室制备，批号：20121212)；三九胃泰颗粒(华润三九制药有限公司，批号：1307014)；枸橼酸铋钾颗粒(丽珠集团丽珠制药厂，批号：1308351)；一氧化氮测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：20140307)；丙二醛测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：20140310)；SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20131129);PGE2试剂盒(上海原叶进口分装，批号：20140301A)；考马斯亮兰试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20140417)。
1.1.3 仪器AL204-N电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；TD5A-WS离心机、TDL-5M冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；HH-S4数星恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；680 酶标仪(日本)；DHP-9082电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津)；游标卡尺(上海九量五金工具有限公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 石榴皮多酚有效部位中试工艺流程
1.2.2 石榴皮多酚有效部位最大浓度的配制方法
精密称取中试产品石榴皮多酚有效部位粉末4.35 g，用3 mL生理盐水配成1 450 g·L-1混悬液。
1.2.3 石榴皮多酚有效部位对小鼠单次给药毒性试验 1.2.3.1 预试验取昆明种小鼠10只，♀♂各半，每组5只，适应性喂养3 d后，随机分为2组：石榴皮多酚有效部位组和生理盐水对照组。实验前禁食不禁水12 h后，石榴皮多酚有效部位组给药量为29 000 mg·kg-1,按0.2 mL·10 g-1 灌胃给药1次，对照组灌胃等体积的生理盐水，灌胃后连续观察3 d，结果小鼠全部死亡。根据小鼠的死亡情况对给药剂量作适当的调整，分别找出石榴皮多酚有效部位引起动物死亡的LD100值(100%死亡率)、LD0值(0%死亡率)和相应的剂量组间距r值，进行LD50值的测定。经预试验得出，石榴皮多酚有效部位的最小全致死量(Dm)为16 000 mg·kg-1，最大全不致死量(Dn)为5 000 mg·kg-1，正式试验设定5个剂量组，求出剂量比，确定r值为0.75。
1.2.3.2 石榴皮多酚有效部位半数致死量LD50的测定昆明种小鼠50只，♀♂各半，体质量18~22 g，按性别和体重随机分为A、B、C、D、E 5个组，每组10只，各组剂量按1 ∶ 0.75的比例进行设置为16 000、12 000、9 000、6 750、5 063 mg·kg-1；各组动物禁食不禁水12 h后，分别以上述5个剂量的石榴皮多酚有效部位进行灌胃，灌胃体积为0.2 mL·10 g-1，灌胃1次，灌胃后观察每组小鼠给药后的反应并记录小鼠的精神状态、行为活动、饮食饮水、死亡情况等，连续观察14 d，对死亡小鼠及时解剖，肉眼观察主要脏器体积、颜色和质地的变化，对异常脏器进行组织病理学检查。
1.2.3.3 LD50计算LD50采用Bliss几率单位法进行计算。
1.3 石榴皮多酚有效部位对无水乙醇致大鼠胃溃疡的保护作用 1.3.1 动物分组、造模与给药Wistar 大鼠70只，♀♂各半，体质量180~220 g，按性别和体重随机分为正常组、模型组(给予生理盐水1 mL·100 g-1)、三九胃泰颗粒组(中药对照组，1 850 mg·kg-1)、枸橼酸铋钾颗粒组(西药对照组，33 mg·kg-1)、石榴皮多酚有效部位低、中、高剂量组(给药剂量根据LD50值的1/5、1/10、1/20计算为430、852、1 704 mg·kg-1)，每组10只。各组大鼠按设定剂量灌胃给药，灌胃体积为1 mL·100 g-1,每天1次,连续灌胃给药10 d。d 9给药后禁食不禁水24 h[19],末次灌胃给药2 h后,除正常组外，其余各组均灌胃给予无水乙醇，每只1.5 mL，制备急性胃黏膜损伤模型。1 h后[20]，处死大鼠，打开腹腔并结扎贲门和幽门，向胃腔内注入1%甲醛溶液2 mL,取出胃并浸入1%甲醛溶液中，30 min后沿胃大弯剪开胃壁，展平，用冰生理盐水冲洗胃内壁，用小棉球轻轻将胃黏液及血凝块擦掉，在10倍放大镜下观察胃黏膜损伤程度，胃黏膜的完整度、颜色，有无充血、水肿、糜烂、溃疡及瘢痕组织增生等。
1.3.2 观察指标 1.3.2.1 胃黏膜溃疡指数和溃疡抑制率的计算参照Guth[21]标准，以局限于胃上皮的糜烂、溃疡、出血等的长度累计积分，正常为0分，斑点糜烂计1分，糜烂长度<1 mm计2分，1～2 mm计3分，3～4 mm计4分，>4 mm计5分，各分值相加为该动物的损伤指数总分。按下列公式计算溃疡抑制率：溃疡抑制率/%=(对照组溃疡指数-给药组溃疡指数) /对照组溃疡指数×100%。
1.3.2.2 胃黏膜组织形态学观察从胃窦至胃体取一条状组织，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下进行组织形态学观察。
1.3.2.3 胃黏膜PGE2、NO、SOD、MDA含量测定将“1.3.2.2”项下取完条状组织后余下鼠胃，于冰浴上用滤纸吸干，迅速刮去胃黏膜，于-70℃冰箱贮藏，备用。称重，用冰生理盐水制成10%胃黏膜组织匀浆。4℃下2 500 r·min-1 离心10 min，取上清液，检测步骤均严格按试剂盒说明书进行NO、MDA、SOD、PGE2的测定。
1.4 统计学处理应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量数据以
表示，各组间比较采用t检验；各组率的比较采用确切概率法。
各组小鼠的死亡多发生在灌胃后24～72 h内，小鼠的死亡率随剂量的增加而增高。小鼠灌胃给予石榴皮多酚有效部位的 LD50=8 520.9 mg·kg-1 ； LD5095%的可信限=(7 291.2~9 914.4) mg·kg-1。石榴皮多酚有效部位对小鼠死亡率的影响见Tab1。
低剂量组A中，小鼠未出现明显的毒性反应，且无1例死亡；剂量组B中，个别小鼠出现呼吸频率减慢，行动迟缓，严重者甚至死亡；高剂量组C、D、E中，小鼠灌胃72 h内出现不同程度的毒性反应，具体表现为呼吸频率减慢、精神萎靡、眼眯趴伏、自发活动减少、行动迟缓、蜷缩、对刺激性反应减弱等现象，严重者甚至死亡。随给药剂量增大，毒性反应症状越明显、严重，死亡数目增加。
2.1.3 石榴皮多酚有效部位最大剂量组对主要脏器毒性作用的病理学观察大体解剖观察死亡小鼠的心、肝、脾、肺和肾脏，与对照组相比，均无明显变化。 但从病理组织切片显示，最大给药剂量为16 000 mg·kg-1小鼠的脏器组织有不同程度的损伤：肝脏组织中有的发生不同程度的充血，少数细胞出现固缩、变性；心、肺、肾脏组织发生不同程度的充血，见Fig1。
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| Fig 1 Effect of polyphenols’ effective parts from P. granatum in the maximal dose on the pathological morphology in the main organs of mice(HE×200) A: Liver; B: Heart ；C： Lung；D: Kidney |
与正常组比较，模型组胃溃疡指数明显升高，说明模型制备成功；与模型组比较，石榴皮多酚有效部位高、中剂量组大鼠胃溃疡指数明显降低(P<0.01)，均能明显抑制大鼠乙醇型胃黏膜损伤，溃疡抑制率分别为98%、76%；且效果优于枸橼酸铋钾，见Tab 2。
,n=10)
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HE染色后，光镜下观察可见，正常组大鼠胃窦皱壁均匀分布，上皮细胞排列规则，黏膜肌、腺体、黏膜下层及肌层结构正常。模型组大鼠，乙醇所致胃窦黏膜皱壁表面变性、崩解，部分黏膜上皮细胞呈嗜酸性坏死或融合成片状结构，腺体未见病变，黏膜肌下各层结构正常。石榴皮多酚有效部位低剂量组，大鼠胃窦部黏膜皱壁上皮排列整齐，无明显病变，但部分黏膜表层变性、脱落，固有层无明显炎细胞浸润，腺体结构正常。石榴皮多酚有效部位中剂量组，大鼠胃窦部分黏膜上皮完整，腺体结构正常，黏膜层厚度较低剂量组厚，但有部分黏膜变性、坏死，结构不清。石榴皮多酚有效部位高剂量组，大鼠大部分胃窦黏膜比较完整，上皮细胞有轻度变性，固有层未见明显炎细胞浸润，黏膜下层肌结构正常，见Fig2、3。
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| Fig 2 Effect of effective parts of pomegranate peel polyphenols on the pathological morphology in ethanol-induced rats(HE×200) A：Normal control； B：Model control；C：Sanjiuweitai particles；D：Colloidal bismuth subcitrate；E：Low dose；F：Middle dose；G：High dose |
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| Fig 3 Effect of effective parts of pomegranate peel polyphenols on ethanol-induced rats A：Normal control； B：Model control；C：Sanjiuweitai particles；D：Colloidal bismuth subcitrate；E：Low dose； F：Middle dose；G：High dose |
与模型组相比，枸橼酸铋钾组、石榴皮多酚有效部位中、高剂量组胃黏膜组织中PGE2含量明显增高(P<0.05)，见Tab3。
,n=10)
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与模型组比较,枸橼酸铋钾组、石榴皮多酚有效部位高剂量组能明显提高无水乙醇损伤性胃黏膜组织内NO水平(P<0.05)，见Tab4。
,n=10)
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与模型组比较，石榴皮多酚有效部位高剂量组能提高大鼠胃黏膜SOD活力(P<0.01)，见Tab5。
,n=10)
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与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜组织中MDA含量增加；与模型组比较，枸橼酸铋钾组、石榴皮多酚有效部位中、高剂量组可明显降低MDA含量(P<0.01)，见Tab6。
,n=10)
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石榴皮多酚作为石榴皮中一种重要的生理活性成分，其主要成分为安石榴苷、鞣花酸、没食子酸。根据单次给药毒性试验结果，石榴皮多酚有效部位的LD50为8 520.9 mg·kg-1,其95%的可信限范围为(7 291.2～9 914.4) mg·kg-1，根据全球统一毒性分级系统标准，石榴皮多酚有效部位毒性未分类；根据欧盟毒性分级标准未分类，故石榴皮多酚有效部位在一定浓度范围内临床使用较安全。
胃溃疡发病的原因比较复杂，一般认为是多种原因引起胃黏膜损伤，导致对胃酸、胃蛋白酶的抵御能力降低，从而出现溃疡症状。溃疡病理模型可用化学性、物理性刺激以及通过应激状态诱发。乙醇诱导的胃溃疡模型较其它胃溃疡模型制备方法简单，溃疡发生率高，并且乙醇引起的胃黏膜急性损伤机制明确，有利于研究中药对溃疡预防和保护的机制。
本实验采用乙醇诱导的胃黏膜急性损伤模型，观察石榴皮多酚有效部位对大鼠急性胃溃疡的保护作用。实验结果表明，石榴皮多酚有效部位能明显降低急性胃溃疡大鼠的溃疡指数，并有促进溃疡愈合的作用。PGE2是由胃黏膜内花生四烯酸或亚油酸在环氧酶催化下合成的，具有促进胃黏膜上皮细胞分泌黏液与碳酸氢盐、维持黏膜完整性、抑制胃酸分泌和刺激组织修复来促进溃疡愈合的作用。石榴皮多酚有效部位中、高剂量组与模型组比较有明显差异，说明石榴皮多酚有效部位可促进胃溃疡大鼠上皮细胞合成分泌PGE2,增强胃黏膜防御功能，提高再生黏膜功能,这可能是其促进胃溃疡愈合的机制之一。
NO作为一种内源性血管舒张因子，能调节胃酸和胃黏液分泌及碳酸氢盐生成，在维持黏膜完整性和黏膜防御中直接发挥作用[22]，从而与胃溃疡修复之间存在密切联系。研究表明，石榴皮多酚有效部位可以提高无水乙醇型大鼠胃溃疡模型胃黏膜组织中NO含量，说明该药物可能有增强胃黏膜屏障作用。
SOD是机体内一种重要的内源性氧自由基清除剂，具有修复细胞的功能，故机体内环境中SOD活性的高低间接性反映机体清除自由基的能力。MDA是脂质过氧化反应得到的终末产物，在体内的含量可反映脂质过氧化的程度，从而间接反映出细胞受损程度。本实验结果显示，石榴皮多酚有效部位可提高SOD活性及降低MDA含量，表明石榴皮多酚有效部位能增强胃溃疡大鼠的抗氧化能力，进而抑制溃疡的发生和发展。
综上所述，石榴皮多酚有效部位可提高无水乙醇致胃溃疡模型大鼠中PGE2、NO水平、SOD活性及降低MDA含量，对无水乙醇致大鼠胃溃疡模型具有胃黏膜保护作用，其机制可能与促进胃溃疡上皮细胞合成、增强胃黏膜防御功能，维持黏膜屏障的完整性，进而减少自由基生成、降低抗脂质过氧化反应酶的消耗和调控NO水平有关。
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