2. 南华大学附属第一医院呼吸内科, 湖南 衡阳 421001
2. Dept of Respiration, the First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang Hunan 421001, China
肺纤维化(pulmonary fibrosis)是以肺泡间质炎性细胞浸润、成纤维细胞异常增殖和胶原蛋白沉积为特征的免疫介导的慢性炎症性疾病,是许多病因不同的肺间质疾病的共同结局,临床表现主要为进行性呼吸困难,患者最终因呼吸衰竭而死亡,目前仍缺乏有效的治疗手段,因此,寻找抗肺纤维化的有效药物已成为当前医学的迫切需要[1, 2, 3]。肺成纤维细胞由胚胎时期的间充质细胞分化而来,构成肺脏结缔组织中主要的细胞成分,在病理条件下,这些细胞也是肺纤维化形成过程中的最重要效应细胞,一方面,通过自身不断增殖合成大量胶原蛋白参与肺纤维化的进程,另一方面,分泌多种细胞因子促进肺纤维化的进展[4]。白藜芦醇(resveratrol,Res)是从植物中提取的一种非黄酮类多酚化合物,分子式为C14H12O3,具有广泛的药理活性。本课题组前期研究显示,Res对博莱霉素所致的大鼠肺纤维化具有良好的治疗作用[5, 6, 7, 8]。近年众多研究证实[9, 10, 11],Res也有较强的抗心脏成纤维细胞及肿瘤细胞增殖效应。然而,Res对肺成纤维细胞生长的影响仍不清楚。因此。本研究以人胚肺成纤维细胞MRC-5为研究对象,观察Res对MRC-5细胞增殖、细胞周期进展和凋亡的影响,旨在进一步阐述Res抗肺纤维化的分子机制,从而为其临床应用提供更多的理论基础和实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料人胚肺成纤维细胞株(MRC-5)由中国科学院上海细胞库提供。Res购于西安天一生物技术有限公司,产品批号:070115,纯度≥98%。新生胎牛血清及RPMI 1640培养基购于Gibco公司。四甲基偶氮唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide,MTT]试剂盒购自江苏碧云天公司。二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、碘化丙啶由美国 Sigma公司提供。原位缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)凋亡检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒购于Ferments公司。兔抗人细胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1,Cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)、Bcl-2、Bax、β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养MRC-5细胞复苏后接种于含10%新生胎牛血清的RPMI 1640培养基中,置入37℃、5%CO2培养箱进行细胞培养,待细胞生长至融合状态后,以0.25%的胰蛋白酶消化,并进行传代培养,当培养细胞达到一定数量,且呈现对数生长时待用。
1.2.2 细胞分组取处于对数生长期的MRC-5细胞,制成单细胞悬液,并接种于96孔板中,每孔1×106个细胞,约 100 μL,然后加入0.18 mL培养液,继续培养 24 h,待细胞贴壁后分为溶媒组(DMSO)和Res(溶解于DMSO中)处理组,每组平行设置5个样本。
1.2.3 MTT检测细胞增殖Res处理组加入0(DMSO)、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1的Res各20μL,溶媒组加入相同体积的DMSO,共同培养24、48、72 h后,滴加已配好的20 μL MTT溶液(5g·L-1),继续孵育4 h,然后结束培养,将每孔内的培养上清液小心弃去,加入150 μL的DMSO,轻轻振荡约10 min,使结晶能够完全溶解,以DMSO调零,在Bio-Tek808酶标仪上,570 nm波长处测定每个孔的吸光度(optical density,OD)值,计算不同浓度Res的细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率/%=(溶媒组OD值-Res处理组OD值)/溶媒组OD值×100%。
1.2.4 流式细胞术检测细胞周期和凋亡率Res处理组分别加入50、100 μmol·L-1的Res 20 μL,溶媒组加入20 μL DMSO,孵育48 h后,PBS洗细胞3次,并用胰蛋白酶消化,1 500 r·min-1离心3 min,重复以上操作3次,收集细胞沉淀,加70%并4℃预冷的乙醇固定过夜,24 h后离心去上清,加入1mL碘化丙啶染液,4℃避光30 min,用400目的筛网过滤1次。采用FACS420流式细胞仪(美国Beckerman coulter 公司)进行检测,计算细胞周期各时相 DNA的百分含量及凋亡率。
1.2.5 TUNEL检测细胞凋亡经20 μL DMSO以及50、100 μmol·L-1 Res分别处理MRC-5细胞48 h后,采用TUNEL检测MRC-5细胞凋亡。凋亡细胞表现为胞核中出现棕黄色颗粒。在400高倍视野下,每张切片随机取5个区域,计数每个区域中细胞核数及凋亡阳性细胞核数,取其平均值,按下式计算凋亡指数(apoptosis index,AI),AI/%=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.2.6 荧光实时定量PCR取经20 μL DMSO以及50、100 μmol·L-1 Res干预48 h 的MRC-5细胞,采用TRIzol试剂提取总RNA,并溶解于无RNase的水中,通过紫外分光光度计测定每个样本总RNA 的A260/280,其比值均在1.8~2.0之间,符合实验要求。取总RNA 2 μg,按照逆转录试剂盒提供的方法合成cDNA。Cyclin D1、CDK4、β-actin引物序列参照文献[12],由上海生工生物工程公司合成,其中Cyclin D1引物序列:上游5′-CTCCTGGTGAACAAGCTCAAGT-3′,下游5′-GCGGTAGTAGGACAGGAAGTTG-3′,PCR扩增产物长度为258 bp;CDK4引物序列:上游5′-GGGACCGTCAAGCTGGCTGA-3′,下游5′-TCGAGGCCAGTCGTCTTCTG-3′,PCR扩增产物长度为267 bp;β-actin引物序列:上游5′-CCCACACTGTGCCCATCTACG-3′,下游5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′,PCR扩增产物长度为205 bp。取10 μL逆转录产物进行PCR反应,反应条件:94℃预变性3 min,94℃变性40 s,62℃复性40 s,72℃延伸1 min,总共35个循环。用ΔΔCt值法,以β-actin为内参照,定量Cyclin D1、CDK4 mRNA的表达水平。
1.2.7 Western blot细胞处理过程同上,收集细胞,通过三去污裂解液将细胞匀浆,吸出上清液,并进行蛋白定量。常规制备SDS-PAGE胶,20 μg蛋白质样品上样,在70 V电压下电泳1.5 h,转移至PVDF膜。50 g·L-1脱脂奶粉室温封闭,分别加入1 ∶ 500兔抗人Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax、β-actin抗体,4℃孵育过夜后,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶ 2 500)室温孵育1 h,ECL 显色,暗室曝光。利用Labwork凝胶图像分析系统对胶片进行扫描,得出灰度值,目的蛋白(Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax)表达水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。
1.3 统计学处理实验数据以表示,全部资料用SPSS 13.0统计软件进行分析,多组均数比较采用单因素方差分析及两两之间比较的q检验。
2 结果 2.1 Res对MRC-5细胞增殖的抑制作用通过MTT法分析Res干预对MRC-5细胞增殖的影响(Fig1),发现随着Res浓度的升高和处理时间的延长,其对MRC-5细胞增殖的抑制率逐渐增加,在同一Res浓度(12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)组内,干预24、48、72 h后细胞增殖抑制率两两之间比较,差异均有显著性(P<0.01)。同样,在同一时点内,各Res处理组细胞增殖抑制率比较,差异均有显著性(P<0.01),见Fig1。
2.2 Res对MRC-5细胞周期的影响以50、100 μmol·L-1 Res 20 μL分别处理MRC-5细胞48 h 后,采用流式细胞术分析细胞周期各时相 DNA比例,结果显示,50、100 μmol·L-1 Res处理组G0/G1期DNA比例增加,S、G2/M期DNA比例降低,与溶媒组比较,差异均有显著性(P<0.01),而且100 μmol·L-1 Res处理组G0/G1期DNA比例高于50 μmol·L-1 Res处理组(P<0.01),但S、G2/M期DNA比例低于50 μmol·L-1 Res处理组(P<0.01),见Fig2、3。
2.3 Res对MRC-5细胞Cyclin D1、CDK4表达的影响为了进一步阐明Res使细胞生长停滞在G0/G1期的机制,通过荧光实时定量PCR和Western blot测定MRC-5细胞中Cyclin D1、CDK4表达,如Fig4、5所示,与溶媒组相比,50、100 μmol·L-1 Res处理组Cyclin D1、CDK4 mRNA与蛋白表达水平下调(P<0.01),此外,100 μmol·L-1 Res处理组Cyclin D1、CDK4 mRNA与蛋白表达水平较50 μmol·L-1 Res处理组下降(P<0.01)。
2.4 Res对MRC-5细胞凋亡的影响TUNEL染色发现,溶媒组仅有少量MRC-5细胞凋亡,给予50、100 μmol·L-1 Res处理细胞48 h后,AI明显上升,与溶媒组比较,差异均有显著性(P<0.01),而且100 μmol·L-1 Res处理组AI高于50 μmol·L-1 Res处理组(P<0.01),见Fig6。此外,通过流式细胞术检测各组MRC-5细胞凋亡率,其变化趋势与AI相似,见Fig7、8。
2.5 Res对MRC-5细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影 响通过Western blot测定MRC-5细胞Bcl-2、Bax蛋白表达,由Fig9可知,经20 μL的50、100 μmol·L-1 Res孵育MRC-5细胞48 h后,Bcl-2蛋白表达水平下调,Bax蛋白表达水平上调,与溶媒组比较,差异均有显著性(P<0.01),另外,100 μmol·L-1 Res处理组Bcl-2蛋白表达水平较50 μmol·L-1 Res处理组减少(P<0.01),而Bax蛋白表达水平较50 μmol·L-1 Res处理组升高(P<0.01)。
3 讨论Res广泛存在于葡萄、花生、虎杖多种植物体内,是植物在受到紫外线照射、外来病菌入侵等不利条件下产生的一种植物抗毒素。随着研究的深入,目前已发现Res具有多种药理活性,如抗肿瘤、抗炎、抗纤维化、降压、抗血小板聚集、抗氧化以及抗细菌和真菌感染等[13, 14, 15]。张黎等[16]用Res处理小鼠胚胎成纤维细胞,发现Res能明显抑制细胞增殖。另外,Res给药呈剂量依赖性地阻碍人皮肤肥厚性瘢痕组织中成纤维细胞的生长[17]。本研究应用MTT法分析Res干预对MRC-5细胞增殖能力的影响,发现随着Res浓度的升高和处理时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐增加,表明Res在体外能抑制MRC-5细胞增殖,并且具有时效和量效关系。
细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,分为间期(G1、S、G2)与分裂期(M)两个阶段,与细胞增殖密切相关。已有研究证实,Res与体外培养的神经母细胞瘤 SH-SY5Y细胞共同孵育,能够阻止 G1期细胞进入 S期[18]。本实验结果显示,采用50、100 μmol·L-1 Res处理MRC-5细胞48 h后,G0/G1期DNA比例升高,而S、G2/M期DNA比例降低,并且100 μmol·L-1 Res作用强于50 μmol·L-1,提示Res可阻止MRC-5细胞周期的正常进行,使细胞停滞于G0/G1期,减少了DNA合成和有丝分裂,从而发挥抑制细胞增殖的作用。Cyclin D1为G1期的正性调控蛋白,当其与 CDK4结合后,驱使细胞通过R(restriction point)点,由G1期进入S期而实现细胞分裂增殖。陈加顺等[19]报道,Res作用于人肺腺癌 A549细胞后,Cyclin D1表达明显下调,细胞活性降低。为了进一步探讨Res诱导MRC-5细胞周期阻滞于G0/G1期的机制,本研究采用荧光实时定量PCR和Western blot检测经50、100 μmol·L-1 Res处理后的MRC-5细胞Cyclin D1、CDK4表达,结果发现,随着Res浓度的升高,Cyclin D1、CDK4 mRNA与蛋白表达水平逐渐减少,因此,Res通过下调Cyclin D1、CDK4表达使细胞不能通过R点,这可能是Res抑制MRC-5细胞周期进展的重要机制。
细胞凋亡又称为程序性死亡,它是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而引起细胞死亡的方式。Bcl-2、Bax被认为是调控凋亡最重要的2个因子,Bcl-2抑制细胞凋亡,Bax则促进细胞凋亡。最近,顾生玖等[20]发现,汉黄芩素通过下调Bcl-2表达及上调Bax表达诱导肝癌细胞HepG-2凋亡。Liu等[21]报道,Res通过激活caspase-3、9,增加人胃癌SGC7901细胞凋亡率。因此,Res诱导细胞凋亡特性可能对MRC-5细胞增殖具有一定的抑制作用。的确,将50、100 μmol·L-1 Res加入MRC-5细胞后,AI、凋亡率和Bax表达水平明显增加,Bcl-2表达水平降低,并且浓度越高,效果越明显,表明Res通过减少Bcl-2/Bax比例刺激MRC-5细胞凋亡,从而发挥抗MRC-5细胞增殖效应。
综上所述,本研究结果证实了Res能有效抑制体外培养的人胚肺成纤维细胞MRC-5生长,一方面通过下调Cyclin D1、CDK4表达阻滞细胞周期进展,另一方面通过降低Bcl-2表达及增加Bax表达促进细胞凋亡,这从新的视角阐明了Res抑制肺纤维化发生、发展的机制。因此,深入开展Res抗肺纤维化作用的研究可能为这种疾病的治疗带来新的思路和希望。
[1] | Cottin V. Current approaches to the diagnosis and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis in Europe:the AIR survey[J]. Eur Respir Rev, 2014, 23(132):225-30. |
[2] | Cottin V, Crestani B, Valeyre D, et al. Diagnosis and management of idiopathic pulmonary fibrosis:French practical guidelines[J]. Eur Respir Rev, 2014, 23(132):193-214. |
[3] | Duck A. Management of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Nurs Times, 2014, 110(16):16-7. |
[4] | 高 建, 刘 干, 李 俊. 肺成纤维细胞在肺纤维化进程中的作用[J]. 中国药理学通报, 2010, 26(9):1125-9. Gao J, Liu G, Li J. The role of fibroblasts in pulmonary fibrosis[J]. Chin Pharmacol Bull, 2010, 26(9):1125-9. |
[5] | 刘理静, 于小华, 张 平. 白藜芦醇通过TGF-β1/ADAMTS-1信号通路抑制肺纤维化[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(3):425-31. Liu L J, Yu X H, Zhang P. Resveratrol inhibits pulmonary fibrosis through TGF-β1/ADAMTS-1 signaling pathway[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29(3):425-31. |
[6] | 李婉霜, 张 平, 何平平. 白藜芦醇对大鼠肺纤维化逆转作用的研究[J].临床医学工程, 2012, 19(2):185-7. Li W S, Zhang P, He P P. Reverse of bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats by the effects of resveratrol[J]. Clin Med Engin, 2012, 19(2):185-7. |
[7] | 何平平, 王在岩, 张 平. 不同剂量白藜芦醇对博来霉素致大鼠肺纤维化的干预比较[J].临床肺科杂志, 2012, 17(1):3-5. He P P, Wang Z Y, Zhang P. Comparison of intervention with different dosages of resveratrol on rats of pulmonary fibrosis induced by bleomycin[J]. Clin Lung J, 2012, 17(1):3-5. |
[8] | 王在岩, 张 平, 何平平, 等. 白藜芦醇对博来霉素致大鼠肺纤维化和NF-κB mRNA 的影响[J].临床肺科杂志, 2011, 16 (9):1315-7. Wang Z Y, Zhang P, H e P P, et al. Effects of resveratrol on bleomycin-induced pulmonary fibrosis of the rat and expression of NF-κB[J]. Clin Lung J, 2011, 16(9):1315-7. |
[9] | 王世君, 王兴祥, 范芳华, 等. 白藜芦醇抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖的实验研究[J]. 中国中西医结合杂志, 2008, 28(4):334-9. Wang S J, Wang X X, Fan F H, et al. Inhibitory effect of resveratrol on cardiac fibroblast proliferation induced by angiotensin Ⅱ[J]. Chin Interg TCM-WM J, 28(4):334-9. |
[10] | 何广辉, 孙丰源. 白藜芦醇对淋巴瘤BJAB细胞体外增殖及细胞周期作用的研究[J]. 天津医科大学学报, 2014, 20(5):360-3. He G H, Sun F Y. Effects of resveratrol on the proliferation and cell cycle of lymphoma BJAB cells in vitro[J]. J Tianjin Med Uni, 2014, 20(5):360-3. |
[11] | 严月华, 徐 丽, 吴剑波, 盛晚香. 白藜芦醇对人皮肤T细胞淋巴瘤Hut-78细胞增殖和凋亡影响观察[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2013, 20(23):1807-11. Yan Y H, Xun L, Wu J B, Sheng W X. Effect of resveratrol on inducing proliferation and apoptosis of T cell lymphoma cell line Hut-78 cells[J]. Chin J Cancer Prev Treat, 2013, 20(23):1807-11. |
[12] | 于明哲, 李 俊, 黄 成, 等. 蜂毒素对人胚肺成纤维细胞生长的抑制作用及其机制探讨[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(7):918-22. Yu M Z, Li J, Huang C, et al. Inhibitory effect of melittin on growth of human lung fibroblasts[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29(7):918-22. |
[13] | 安 梅, 周 瑾, 陈晓宇. 白藜芦醇药理学作用的研究进展[J]. 肿瘤药学, 2014, 4(4):242-6. An M, Zhou J, Chen X Y. Pharmacological activities of resveratrol and protection research progress on the body[J]. Anti-tumor Pharmacol, 2014, 4(4):242-6. |
[14] | Aguirre L, Portillo M P, Hijona E, et al. Effects of resveratrol and other polyphenols in hepatic steatosis[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(23):7366-80. |
[15] | 李 洁, 熊兴耀, 曾建国, 等. 白藜芦醇的研究进展[J]. 中国现代中药, 2013, 15(2):100-8. Li J, Xiong X Y, Zeng J G, et al. Advances in resveratrol[J]. Chin Mod Trad Chin Med, 2013, 15(2):100-8. |
[16] | 张 黎, 李 勇, 张 洁, 张秋红. 白藜芦醇对小鼠胚胎成纤维细胞增殖和细胞周期的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2009, 25 (12):1109-11. Zhang L, Li Y, Zhang J, Zhang Q H. Effects of resveratrol on the proliferation and cell cycle of mouse embryonic fibroblasts[J]. Chin J Cell Mol Immunol, 2009, 25 (12):1109-11. |
[17] | Zeng G, Zhong F, Li J, et al. Resveratrol-mediated reduction of collagen by inhibiting proliferation and producing apoptosis in human hypertrophic scar fibroblasts[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2013, 77(12):2389-96. |
[18] | 郑 敏, 张 黎, 刘 靖, 李 勇. 白藜芦醇对体外培养的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞周期与凋亡的影响[J]. 神经解剖学杂志, 2013, 29(1):25-9. Zheng M, Zhang L, Liu J, Li Y. Effect of resveratrol on the cell cycle and apoptosis of neuroblastoma SH-SY5Y in vitro[J]. Chin J Neuroanat, 2013, 29(1):25-9. |
[19] | 陈加顺, 吕俊明, 束永前. 白藜芦醇对人肺腺癌 A549细胞周期的影响及其机制研究[J]. 临床肿瘤杂志, 2011, 16(6):506-10. Chen J X, Lv J M, Shu Y Q. Effects of resveratrol on cell cycle regulatory processes of human lung adenocarcinoma A549 cells and its mechanism[J]. Chin Clin Onco, 2011, 16(6):506-10. |
[20] | 顾生玖, 李美波, 朱开梅. 虎杖中白藜芦醇诱导肝癌细胞HepG-2凋亡及其对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2014, 15(20):168-72. Gu S J, Li M B, Zhu K M. Apoptosis of HepG-2 cells induced by resveratrol and its effects on Bcl-2 and Bax protein expression[J]. Chin J Exp Trad Med Form, 2014, 15(20):168-72. |
[21] | Liu M L, Zhang S J. Effects of resveratrol on the protein expression of survivin and cell apoptosis in human gastric cancer cells[J]. J Buon, 2014, 19(3):713-7. |