2. 宝鸡市人民医院神经内科, 陕西 宝鸡 721000;
3. 第四军医大学生理教研室, 陕西 西安 710032
2. Dept of Neurology, Baoji City People's Hospital, Baoji Shanxi 721000, China;
3. Dept of Physiology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China
脑卒中是危害人类健康和生命的常见病和多发病,现已成为全球第二大常见死因[1]。缺血性卒中约占全部脑卒中的80%,而缺血性卒中约80%是由大脑中动脉血栓形成或栓塞引起的[2]。缺血性脑卒中尤其脑缺血后的再灌注损伤危害极大。缺血性卒中的负担在逐年持续增加[3],大脑中动脉卒中有很高的死亡率及致残率,恶性大脑中动脉梗塞通常发病率在10万分之10~20,女性偏多,死亡率80%[4]。
传统药物治疗仅能防止斑块增大或脱落,防止新的梗塞或梗塞进展,对已形成的梗塞作用不大[5];溶栓治疗受时间窗限制;血管内治疗存在时间窗限制、费用高、技术设备要求高、远期结果不优于强化药物治疗的不足[6]。基因治疗为缺血性疾病开创了新的治疗途径。既往研究表明,肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)具有快速扩张血管、增加血运的作用[7]。PR39具有促进血管生成的细胞因子和受体在组织缺血缺氧时持续高度表达,快速改善脑组织的缺血状态及明显减小缺血区面积的作用[8, 9, 10]。
本研究前期借助基因重组技术,将PR39和ADM整合,转载至重组腺相关病毒,得到使二者协同表达的rAAV-PR39-ADM。本研究通过建立大鼠脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型,观察rAAV-PR39-ADM对大鼠I/R损伤大脑的保护作用及其可能的机制。
1 材料与方法 1.1 血管形成实验[11]人脐静脉内皮细胞培养,选取第2代到第4代行血管形成实验,将基质胶(BD公司)4℃融化过夜,枪头、枪头盒预冷,在96孔板中选择3列,分别作为空白对照、空病毒及rAAV-PR39-ADM组,每组3个孔,在选定的每个孔中枪头垂直加入50 μL基质胶,后放入温箱30min使胶凝固。取出96孔板,在选定的孔中加入预处理的各组细胞,细胞计数,每孔1×104个细胞。每隔1 h观察1次,观察12 h,每4~6 h记录1次实验结果[12]。
1.2 实验动物与分组正常♂清洁型SD大鼠96只,体质量250~300 g(第四军医大学动物实验中心),随机分为假手术组(Sham)、I/R组:I/R+生理盐水、I/R+空病毒组及I/R+rAAV-PR39-ADM组,每组24只。
1.3 大鼠脑缺血/再灌注模型的制备采用改良Longa线栓法[13]制备大鼠右侧大脑中动脉I/R模型。大鼠经水合氯醛(350 mg·kg-1,ip)麻醉后,颈部正中切口,游离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉,颈总动脉插入制备好的线栓(0.24 mm鱼线,头端烧一直径约0.3 mm的圆头),线栓插入深度距颈动脉分叉处约(18±1) mm,遇阻力停止。栓塞2h后,缓慢拔出线栓,再灌注模型制备成功。Sham组除不插入线栓外,其余均同I/R组。制模成功标志:右侧的Homer综合征,右侧眼球呈暗灰白,左侧眼球红色。改良的神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS)[14],进行神经功能评价。采用美国GE公司Signa 3.0T超导核磁共振扫描仪,行T1WI、T2WI、T2FLAIR和DWI扫描,层厚/层间距为2/0.2 mm,像素256×192。MRI示长T1WI、T2WI信号,高T2FLAIR和DWI信号说明模型成功。
1.4 给药方式各组大鼠在再灌注24h后,分别经过股静脉注射给药或生理盐水,sham组和生理盐水组给予0.3 mL的生理盐水;治疗组给予rAAV-PR39-ADM 3×109 pfu·mL-1 0.3 mL,空病毒组给予腺病毒3×109 pfu·mL-1 0.3 mL,压迫止血后,缝合皮肤。分别在1、2、3、4周四个时间点分别取材进行TTC染色、测定梗塞体积和HE染色的相关检查。
1.5 脑梗死面积测定各组大鼠分别在1、2、3、4周四个时间节点进行脑梗死面积的测定,每组6只,具体操作如下:大鼠经3.5%水合氯醛麻醉后,迅速开胸用冰的生理盐水行心脏灌流[15],灌流后快速取脑并用冰的生理盐水漂洗,洗净的脑组织迅速放入-20℃冰箱里冷冻,20 min后取出脑组织,冠状位切5~6片,每片厚约2 mm[16]。切好的脑组织用0.1%的TTC(Sigma公司)磷酸缓冲液37℃孵育染色30 min[17],4%多聚甲醛固定,24 h后拍照。正常脑组织TTC染色显示为鲜红色,梗死区则为白色。利用Optimas5图像分析软件计算梗死体积。
1.6 组织病理学检测各组大鼠在不同时间点,用冰的生理盐水经心脏灌流后迅速取脑,4%多聚甲醛固定24~48 h,常规石蜡包埋切片,苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,光镜下观察其病理学变化。
1.7 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。用单因素或多因素方差分析(ANOVA)进行组间差别比较,数据以表示。
2 结果 2.1 血管形成实验结果人脐静脉内皮细胞经培养后,在基质胶中观察其血管形成能力,显微镜下观察,与对照组(PBS)及空病毒组比较,rAAV-PR39-ADM组有明显的促血管成型的作用(Fig1)。
2.2 磁共振验证模型制备成功[18, 19]Sham组大鼠头颅MRI检查未见异常(Fig2A),大鼠在缺血2 h,再灌注24 h后行头颅MRI检查,结果示右侧脑组织皮层及皮层下缺血改变(Fig2B),说明模型制备成功。
2.3 神经功能缺损评分比较I/R组造模成功后,神经功能缺损评分比较组间差异无统计学意义(P>0.05)(Tab1),1、2、3、4周,治疗组神经功能缺损评分同I/R+生理盐水组及I/R+空病毒组比较均明显减小(P<0.01)。
2.4 脑梗塞体积比较大鼠脑组织染色后,除假手术组无梗塞外,其余各组均可见右侧大脑皮质下部,基底节外侧白色梗塞灶(Fig3)。与假手术组相比,I/R组的梗塞体积明显增加(P<0.01)。I/R组梗塞灶体积比较: V治疗组<V生理盐水组及V空病毒组(P<0.01)。V生理盐水组及V空病毒组比较梗塞体积无差异(P>0.05)(Fig4)。
2.5 HE染色病理学观察脑组织切片HE染色,光镜下sham组脑组织可见大量神经元,胞体呈多形性,胞质透亮,细胞核大,呈圆形或卵圆形,核仁明显(Fig5A)。I/R组大鼠脑缺血区可见大片神经元消失、稀疏,排列不规则(Fig5B),数量明显减少;随着再灌注时间的延长,缺血脑组织出现间质水肿疏松,神经细胞胞质浓缩红染,胞核皱缩或溶解、碎裂(Fig5),细胞间隙明显增大,梗死灶周围胶质细胞明显增多。同sham组比较,I/R组正常神经元明显减少,大量神经元出现胞核皱缩或溶解、碎裂。同I/R+空病毒和I/R+生理盐水组比较,I/R+rAAV-PR39-ADM组缺血半暗带区胞核皱缩或溶解、碎裂的神经元明显少,正常神经元细胞数量增多。
3 讨论基因治疗为缺血性疾病开创新的治疗途径。重组腺相关病毒载体(rAAV)来源于非致病的野生型腺相关病毒株,具有安全性好、宿主细胞范围广(分裂期和静息期细胞)、免疫源性低,在体内表达外源基因水平高、时间长等特点,是最有前途的基因转移载体之一,在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用[20]。既往研究表明,被誉为血管生成总开关的PR39,可以同时提高VEGF、KDR、FLT1、FGFR1等多种促血管生成相关基因的表达[21],外源性PR39可选择性抑制泛素-蛋白酶体对低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)的降解,从而使HIF-1α保持在一个相对高的浓度,提高VEGF、VEGF受体、KDR、FLT-1以及FGFR1等的表达[10],促进新生血管形成和侧枝循环的建立[22, 23]。Wu[24]与Ramanathan等[25]学者的研究发现,PR39通过保护IAP-2(凋亡抑制因子)来降低caspase-3(半胱天冬酶)的活性,具有抗凋亡的作用。增加缺血组织内PR39浓度,在梗死早期可以阻断凋亡信号转导途径,减少细胞凋亡及迟发性细胞坏死[26]。肾上腺髓质素(ADM)是由52个氨基酸基组成,可增加大鼠血小板环磷酸腺苷(cAMP)水平的新的活性多肽。ADM在中枢神经系统内作为一种保护因子,对脑缺血缺氧性损伤起保护作用,脑室内注射ADM能舒张脑血管,增加大脑血流量[27]。ADM具有舒张血管、抑制血管重塑、降压与升压的双重作用[28, 29]。Dogan等利用特发性高血压模型研究发现,在大脑中动脉闭塞前后中枢给予ADM,均能明显地阻止脑血流量的减少,减轻大脑缺血损伤。Serrano等[30]也证实了ADM对脑组织的这种保护作用,ADM具有调节神经元胶质细胞的活性,促进神经保护/再生的作用[31]。Kobayashi等[32]研究后提出,ADM对脑血管疾病、脑衰老、进行性脑病变等有一定的预防和治疗意义。
既往关于PR39和ADM的研究多用于心肌梗死、心肌I/R损伤、肾梗死及肠缺血等,对于脑梗塞及脑I/R损伤的研究甚少。本课题使用单一信号肽引导多种蛋白质和肽的分泌表达技术实现缺氧诱导条件下的PR39和ADM二种血管活性肽的分泌表达。前期研究主要集中在心肌I/R的研究,本实验首次将该药物应用于大鼠脑I/R损伤的研究,验证其改善脑I/R后局部供血及侧枝循环,保护神经元,促进血管再生,减轻I/R脑损伤的作用。PR39和ADM双基因协同分泌表达,共同发挥其作用,缺血发生后发挥PR39提高多种促血管生成相关基因的高表达作用,同时ADM发挥其调节血压的作用,二者的协同作用有利于侧枝循环的建立,同时为新生血管的生成奠定基础;再灌注后ADM调节血压避免过度灌注,减轻再灌注损伤,同时发挥其保护神经元作用,挽救缺血半暗带区更多的神经元,与PR39在缺血半暗带区生成新生的血管发挥协同作用,为改善患者的预后、促进肢体功能的恢复打下良好基础。离体实验通过血管成型实验验证该药的促进血管形成能力,采用小管形成实验能模拟人体内毛细血管生成的过程,包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤,接近人体内血管生成的实际过程[33]。通过实验发现,rAAV-PR39-ADM组相邻细胞凸起,相互连接形成花环状血管样结构,证实其有明显的促血管形成能力,为在动物模型的应用打下良好的基础。动物实验选用SD大鼠制备脑I/R损伤模型,大鼠具有种系内纯性好、同系大鼠间遗传差异小、有超强的抗感染能力和生命力、成本低等优点,而且它的基因与人类的基因有98%的同源性,神经系统发达,其脑血管结构与人类非常相似,血管闭塞后缺血范围恒定、重复性好[34]。SD大鼠性情温和、生长快、价格便宜,雌激素对脑损伤有保护作用,所以不可雌雄动物混用[35],术前大鼠禁食12 h,避免血糖对梗塞面积的影响[36]。模型制备完成后改良神经功能缺损评分可以很好地判断模型制备成败,大脑中动脉栓塞2 h后拔出线栓,制备再灌注模型即刻量表评分,各组间比较无明显差异,说明模型制备成功、稳定,避免组间差异对后续评判的影响。头颅MRI验证模型制备的成功性直观无创伤。TTC染色直观地验证了这一结论,梗塞体积的计算表明rAAV-PR39-ADM可以减小大鼠脑I/R损伤后梗塞的体积。脑组织切片HE染色可见右侧皮层及皮层下神经元细胞明显减少,再次证明模型制备,随再灌注时间的延长I/R各组缺血区脑组织均出现组织结构稀疏、神经元纤维离散,神经细胞间隙扩大、神经元出现核固缩、溶解等改变,rAAV-PR39-ADM组缺血区正常神经元明显多于I/R+生理盐水组及I/R+空病毒组,同时可见大量新生血管。rAAV-PR39-ADM具有保护神经元,促进血管及神经元再生的作用。主要基于治疗药物中的PR39能促进血管生成和侧枝循环建立,Wei等[37]的研究显示,大鼠大脑中动脉闭塞急性期,侧支动脉急性扩张30 d后,血管内径可增至原来的2倍,长度也增加,而且可观察到大量新生血管。新生血管有助于血流恢复和预后改善。闭塞血管再通后缺血后再灌注不仅没有使组织功能恢复,反而使缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重,这种现象即I/R损伤。治疗药物AAV-PR39-ADM中的ADM具有降压与升压的双重作用,在梗塞发生时能阻止脑血流量的减少,促进侧枝循环建立,减轻大脑缺血损伤;闭塞血管再通时使血管扩张,避免脑组织短时间内血流过度灌注,从而减轻I/R损伤。与常规药物治疗比较能明显改善大鼠的神经行为学评分,减少梗死体积。本研究通过基因药物治疗脑I/R损伤,在动物模型上取得了明显的疗效,为临床治疗脑I/R损伤提供新的治疗途径,本研究对药物的作用机制的研究尚不完善,下一步将通过免疫组化、PCR的手段进一步研究其作用机制。期待该药能早日应用于临床,以改善病人临床症状及预后。
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