2. 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所"晶型药物研究"北京市重点实验室, 北京 100050;
3. 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所"天然药物活性物质与功能"国家重点实验室, 北京 100050
2. Beijing Key Laboratory of Polymorphic Drug, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China;
3. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是严重危害中老年人健康的神经退行性疾病，目前现有的治疗药物有很大的局限性和副作用，因此建立能够反映PD临床病因、病理过程的动物模型，寻找新的有效防治PD的药物具有重要意义。6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)是制备PD 大鼠模型的常用神经毒性化合物，动物脑内注射该化合物后可以诱导PD动物模型，具有明显的PD 临床特征。实验证明，制备PD 模型的注射位点为黑质纹状体通路，但不同注射位点对动物模型的病理特征影响很大。
黑质纹状体通路的多巴胺(dopamine,DA)能神经元位于黑质致密部(pars compacta of substantia nigra,SNc)，其轴突通过内侧前脑束(medial forebrain bundle,MFB)，终止于纹状体尾壳核(caudate putamen,CPu)，由于这些部位的DA 能神经元丢失，导致纹状体DA 含量下降，最终导致运动功能受损，出现PD 的典型症状[1, 2]。在黑质纹状体通路的3个位点中，SNc 结构微小，精确注射6-OHDA 到这个位点非常困难，而且该部位主要是神经元胞体，对6-OHDA 毒性作用不敏感，以SNc 作为注射位点制备PD 模型成功率较低。通常制备PD 模型选用的注射位点为MFB 与CPu。单侧损毁MFB 与单侧损毁CPu 的病理表现有所不同，前者会造成大多数神经元坏死，研究重症PD 具有较高价值，而后者神经元退化速率缓慢，与自发性PD 较为相似，在研究轻症PD 时价值较高。本研究分别采用在黑质纹状体通路MFB 和CPu 两个位点注射6-OHDA 诱发PD 大鼠模型的方法，观察了百可利在这两种损伤模型中的作用特点。
百可利(baicalein)是从唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)干燥根中分离得到的黄酮类化合物，化学名称为5,6,7-三羟基黄酮，别名：黄芩素、黄芩苷元，国家药典委员会将其正式命名为百可利。文献报道，百可利具有抗炎、抗菌、抗过敏、抗氧化等广泛的药理活性[3]。本实验室前期围绕PD的发病机制和治疗靶点，建立了6-OHDA 损伤SH-SY5Y细胞模型和PC12细胞模型，采用高通量药物筛选技术，发现百可利有效地减轻6-OHDA致SH-SY5Y细胞和PC12细胞活力的下降、减轻6-OHDA致SH-SY5Y细胞凋亡、促进正常和6-OHDA损伤情况下的PC12细胞分化和轴突生长。进一步实验表明，百可利在不同的PD动物模型均具有抗PD 相关的药理作用[4, 5, 6, 7]。本文采用大脑不同部位注射 6-OHDA 诱导大鼠PD 模型，观察了百可利的治疗作用及作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物Sprague Dawley (SD)大鼠，♂，2～3月龄，体质量180~200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2007-0001。动物饲养在温度(22±1)℃，相对湿度55%～65%，12 h光照周期的环境中。
1.1.2 仪器脑立体定位仪(MP8001,深圳瑞沃德生命科技有限公司)，大鼠自主活动程序自动控制仪(DZIL-2,中国医学科学院药物研究所)，生物机能实验系统(BL-420E+,成都泰盟科技有限公司)，STRONG牙钻(型号: 202N-110LN),高速低温离心机(5810R,美国Eppendorf公司)，高效液相色谱库仑电化学分析系统(HPLC-ECD Coulchem Ⅲ,ESA,美国)，冰冻切片机(SM900,美国Leica公司)，透射电子显微镜(H-7650,Hitachi 公司,日本)。
1.1.3 试剂与药品百可利由中国医学科学院药物研究所“晶型药物研究”北京市重点实验室提供。美多芭片(上海罗氏制药有限公司生产,批号: SH 0502)。6-OHDA、DA、二羟基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)、高香草酸(homovanilic acid,HVA)、阿朴吗啡(apomorphine,APO)购自Sigma-Aldrich公司；酪氨酸羟化酶(trysine hydroxylase,TH)抗体购自Chemicon公司；OX-42抗体购自Santa Cruz公司；卵白素-生物素过氧化物酶复合物(avidin biotin-peroxidase complex,ABC)试剂盒、3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)显色剂，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法 1.2.1 模型建立大鼠以3% 戊巴比妥钠(50 mg·kg-1,ip)麻醉，常规皮肤消毒后，将大鼠头部固定在立体定位仪上，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟，以前囟为准，分别确定左侧MFB和CPu位点。MFB损伤位点坐标为：(1)TB:-2.3 mm,AP:-4.4 mm,ML:1.2 mm,V:-7.8 mm；(2)TB:+3.4 mm,AP:-4.0 mm,ML:0.8 mm,V:-8.0 mm。该组标记为MFB-M。CPu损伤位点坐标为：(1)TB:-3.3 mm,AP:-0.7 mm,ML:2.5 mm,V:-5.5 mm；(2)TB:-3.3 mm,AP:-0.3 mm,ML:3.5 mm,V:-5.5 mm。该组标记为CPu-M。用牙科钻在上述手术位点钻直径约2.5 mm的孔，用微量进样器将6-OHDA(2 g·L-1)溶液5 μL缓慢注入(1 μL·min-1)，注射后留针10 min缓慢出针。假手术组大鼠注射等量的生理盐水。
1.2.2 模型评价于术后d 14、d 21分别注射APO(0.5 mg·kg-1,sc)诱导大鼠旋转。取30 min内转速≥210 r的大鼠作为成功PD模型大鼠。
1.2.3 分组与给药将造模成功的大鼠，随机分为模型组、美多芭组(madopar,50 mg·kg-1,ig)、百可利(200 mg·kg-1,ig)组，每组12只；另取相应注射生理盐水经检测无旋转运动的大鼠各12只为假手术组。分组后灌胃给予美多芭和百可利，假手术组与模型组大鼠灌胃给予蒸馏水2 mL，每日1次，连续3周。
1.2.4 旋转行为学检测模型动物分组后每隔7天于给药后30 min进行旋转行为检测。(方法同“1.2.2”)
1.2.5 自主活动检测给药后30 min 将大鼠放入自主活动箱中，自动记录仪记录10 min 内大鼠自主活动次数。
1.2.6 大鼠肌电测定将电极固定于大鼠后肢肌肉，使用 BL-420E+ 生物信号采集器对清醒大鼠后肢进行肌电(electromyography,EMG)测定，评价其震颤频率。检测条件为：0.015 毫秒(ms)，扫描速度为0.01 秒(s)，10 kHz 滤波。分别测定各组大鼠在给药后0、10、30、60、90、120、180、240、300、420 min 时的震颤频率。每个时间点记录1 min，统计每时间点5 s 的震颤频率。
1.2.7 神经递质检测末次行为学实验结束后，每组取6 只大鼠断头取脑，冰上迅速分离出损伤侧纹状体，放入液氮中。纹状体称重后加入200 μL匀浆液，经超声破碎(200 W，50 s)，离心(12 000 r·min-1，4 ℃，30 min)，上清液用0.22 μm 滤膜过滤，取50 μL 用于测定。
色谱条件为：色谱柱：CAPCELL PAK C18 MG (3 μm，3 mm I.D.×75 mm)，检测柱温35 ℃，流速1.0 mL·min-1；流动相：0.1 mol·L-1 磷酸二氢钠(NaH2PO4) 水溶液含0.85 mmol·L-1辛基硫酸钠(octyl sulfate sodium salt，OSA)、0.5 mmol·L-1 乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)和11％甲醇，用浓磷酸调pH 至3.25。
1.2.8 免疫组织化学检测每组取4 只大鼠，麻醉、灌流固定后，断头取脑，置固定液中固定4 h，以含30% 蔗糖的多聚甲醛固定液内脱水。作连续冰冻冠状切片，片厚为20 μm。切片与一抗稀释液(TH 1 ∶ 500; OX-42 1 ∶ 100)4 ℃ 孵育过夜；然后分别与生物素标记的二抗(1 ∶ 300)反应1 h以及卵白素-生物素复合物反应2 h，最后用含有DAB 的缓冲液呈色。计数方法：随机选取每只大鼠脑切片5张，分别在黑质和纹状体阳性细胞密集区中央部分取4个互不重叠的高倍视野，计数视野内TH、OX-42免疫反应阳性细胞数目。
1.2.9 电镜样品制备及观察假手术组、模型组和百可利组各取2只大鼠(脑组织前固定方法同“1.2.8”)。分离黑质与纹状体，用锋利刀片将组织修成约1 mm3 的小块，并置于4℃ 预冷的5% 戊二醛中固定2 h。4℃ 的PBS缓冲液冲洗，4℃ 1% 锇酸后固定约1 h，4℃ 条件下乙醇梯度常规脱水，Epon812包埋，切片染色后，H-7650型透射电镜观察并拍片。
1.3 统计学分析实验数据用
表示，应用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析和t检验。
动物注射APO 后，假手术组大鼠均无异常表现。MFB-M与CPu-M模型组大鼠给予APO 后，大鼠旋转圈数均在270 r·(30 min)-1 左右，给予百可利治疗后大鼠旋转次数无明显差异(Fig1)。
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Fig 1
Effect of baicalein on rotational behavior in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(, n=12)
A: 6-OHDA-MFB lesioned rats; B: 6-OHDA-CPu lesioned rats. **P<0.01 vs sham group
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两个注射位点模型组大鼠均出现活动明显减少、反应迟钝、肢体震颤、嗅探、偏斜、弓背、尾僵直、竖毛、后肢搔挠、撕咬尾部、躁动不安及激惹等异常行为。与假手术组相比，MFB-M与CPu-M模型组的自主活动次数明显下降(P<0.05)；给予百可利治疗后，MFB-M组大鼠自主活动无明显变化，CPu-M组大鼠自主活动数明显增加(P<0.05)(Fig2)。
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Fig 2
Effect of baicalein on spontaneous activity in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(, n=12)
#P<0.05 vs 6-OHDA group; *P<0.05 vs sham group
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假手术组大鼠静息状态EMG 无明显可检测信号，模型组大鼠后肢肌电可见连续的阵发性簇状电信号出现(P<0.01)，表现出模型大鼠的特殊症状特征。MFB-M 组动物在给予美多芭和百可利后，肌电频率分别比模型组降低37% 和55%，CPu-M 组动物给予美多芭和百可利后肌电频率分别比模型组降低31% 和60%(Fig3)。
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Fig 3
Effect of baicalein on tremor in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(, n=12)
A: Segments of tremor monitor activity profiles; B: Tremor frequency. #P<0.05 vs 6-OHDA group
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MFB-M组与CPu-M组大鼠给予百可利治疗后，药物降低大鼠震颤频率的最大作用出现在约90 min，随后药物作用逐渐减弱。MFB-M 组，大鼠在给药后300 min 基本恢复给药前水平，而CPu-M组，大鼠给药后约在420 min 作用消失(Fig4)。
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Fig 4
Time-response of baicalein on tremor in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(, n=8)
A: MFB model; B: MFB madopar (50 mg·kg-1); C: MFB baicalein (200 mg·kg-1); D: CPu model; E: CPu madopar (50 mg·kg-1); F: CPu baicalein (200 mg·kg-1)
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MFB-M组，模型组纹状体中的DA、DOPAC和HVA的含量明显降低，分别为假手术组2%、4% 和48% (P<0.01)，各给药组对这种损伤的改善不明显；CPu-M组，模型组纹状体中的DA、DOPAC和HVA的含量降低程度略轻，分别为假手术组33%、47%、53%(P<0.05)，各给药组对DA含量有明显的升高作用(P<0.05)，但对其代谢产物无明显作用。美多芭组仅对DA代谢产物HVA有升高作用(Fig5)。
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Fig 5
Effect of baicalein treatment on levels of DA (A), DOPAC (B) and HVA (C) in striatum after 6-OHDA treatment(, n=6)
#P<0.05 vs 6-OHDA group; *P<0.05, **P<0.01 vs sham group
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假手术组大鼠黑质TH 免疫阳性神经元形态清晰，细胞胞体和纤维染色较深，有明显可见的免疫阳性突起。模型大鼠毁损侧黑质TH 免疫阳性神经元变性、坏死，胞质着色淡，细胞轮廓显示不清晰。
MFB-M组，模型组神经元数量为假手术组8%(P<0.01)，给予美多芭和百可利治疗后，对TH 神经元数目的严重下降均有一定的改善趋势，分别为假手术组的16%和18%，但差异均无显著性。CPu-M组，模型组神经元数量为假手术组26%(P<0.05)，给予美多芭和百可利治疗后，可明显提高TH 神经元数目，分别为假手术组的50%和57%(P<0.05)(Fig6A、6B)。
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Fig 6
Effect of baicalein on TH and OX-42 immunostaining in substantia nigra and striatum of rat brain
A: Representative photographs showing. a-d: 6-OHDA-MFB lesioned rats. e-h: 6-OHDA-CPu lesioned rats. (a), (e): sham. (b), (f): 6-OHDA. (c), (g): 6-OHDA + madopar (50 mg·kg-1). (d), (h): 6-OHDA + baicalein (200 mg·kg-1). Scale bars: 100μm; B, C: Positive neurons' A value is expressed as , n=4. #P<0.05,##P<0.01 vs 6-OHDA group; *P<0.05, **P<0.01 vs sham group
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在假手术组大鼠纹状体中，OX-42 免疫阳性小胶质细胞少见。MFB-M组，损毁侧纹状体OX-42 免疫阳性小胶质细胞数量明显增加，为假手术组的3.84倍(P<0.01)，用美多芭和百可利治疗均可明显降低OX-42 免疫阳性小胶质细胞数量，分别下降到模型组49%、38% (P<0.01)。CPu-M组，损毁侧纹状体OX-42 免疫阳性小胶质细胞数量明显增加，为假手术组的3.69倍 (P<0.05)，用美多芭和百可利治疗均可明显降低OX-42 免疫阳性小胶质细胞的数量，分别下降到模型组41%、56%(P<0.05)(Fig6A、6C)。
2.6 神经元超微结构分析未注射6-OHDA 的大鼠神经元结构正常，核染色质均匀，无固缩，胞膜完整；细胞器，如：粗面内质网、核糖体、线粒体的超微结构均正常(Fig7A、D)。MFB-M组中，可见明显固缩的神经元，核染色质成簇，细胞胞质电子密度增高，粗面内质网扩张呈空泡状，核糖体解聚，线粒体肿胀，嵴断裂，CPu-M 组黑质纹状体通路的损伤程 度较MFB-M组略轻(Fig7B、E)。给予百可利进行治疗后，神经元超微结构损伤情况均有不同程度的改善，表现为固缩神经元的数目减少，核与胞质电子密度降低，细胞器情况明显改善，空泡减少(Fig7C、F)。
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| Fig 7 Effect of baicalein on changes of neurons A~C: 6-OHDA-MFB lesioned rats. D~F: 6-OHDA-CPu lesioned rats. A, D: Sham. B, E: 6-OHDA. C, F: 6-OHDA + baicalein (200 mg·kg-1). Scale bars: 0.5μm |
黑质纹状体通路注射6-OHDA 制备的PD 大鼠模型，均可出现肌电的震颤性信号，是PD的特异性行为学表现。本研究发现，黑质纹状体通路不同位点注射6-OHDA 后，其行为学表现和病理检查结果有一定的差异，动物自主活性状态、脑内DA 递质水平、残存神经元数量和神经元超微结构损伤程度均不同，说明不同注射位点制备的PD 模型能够反映PD 不同时期的病理变化，对于观察药物作用具有重要意义。皮下注射APO 诱导大鼠旋转是评价6-OHDA 损伤程度和模型是否成功的标准，但在考察药物的作用时不能仅仅参考这一个标准，还应结合更多与临床症状接近的指标进行全面评价。
百可利是本实验室采用高通量药物筛选技术，围绕PD 的发病机制和治疗药物靶点，经过系统筛选发现的对PD 具有治疗作用的化合物，经动物模型研究和综合评价，证明了百可利对PD 症状，尤其是对PD 引起的震颤有明显的改善[8, 9]。本研究结果表明，百可利对单侧 MFB 位点与CPu 位点注射6-OHDA 后致PD 大鼠模型的震颤活动有明显抑制作用，但是在CPu-M组，百可利抑制震颤频率的效果更好，药效持续时间更长。
自主活动反映了动物的运动能力和中枢神经系统的兴奋程度，本实验结果显示，百可利对CPu位点注射6-OHDA 所致自主活动次数下降具有明显提高作用，这可能与百可利增加脑内DA水平有关。另外，给予百可利治疗后，在DA水平明显提高的情况下，其代谢产物DOPAC 和HVA 水平没有明显变化，说明百可利可能通过抑制单胺氧化酶B活性，影响DA 降解代谢过程，从而改善DA 失衡造成的PD 模型动物运动障碍和静止性震颤。而百可利对MFB 位点注射6-OHDA 所致自主活动降低仅有升高的趋势，与此相对应的是百可利对脑内DA水平表现出一定的升高作用，但差异无统计学意义。
McGeer等[10]于1988年在PD 患者的中脑黑质中发现了激活的小胶质细胞，激活的小胶质细胞产生超氧化物和免疫炎性因子损伤DA 能神经元，抑制小胶质细胞过度激活成为治疗PD 的手段之一[11, 12, 13]。本研究的结果显示，百可利在MFB-M组 和CPu-M 组中均显示出较强的抑制小胶质细胞过度激活的作用，这与早期文献报道的研究结果一致[14, 15]，提示百可利可通过抑制炎性介质的生成和释放，发挥其对DA 能神经元的保护作用。另外，由于MFB-M 组对DA能神经元损伤更严重，因此百可利在此模型中并未显示出明显增加DA能阳性神经元的作用。而在损伤较轻的CPu-M组，百可利则表现出明显的保护神经元的作用，并与递质检测和超微结构分析结果一致。
综上所述，黑质纹状体通路是PD 患者重要的生化和病理改变部位，不同位点的损伤可模拟PD发展的不同阶段，并在病理程度方面存在一定差异，表现为神经元丢失和残存神经元功能减退程度不同。本研究表明，连续给药3 周，百可利能够改善PD 不同发病时期模型动物的行为学症状，并通过抑制炎性介质生成和释放、保护残存神经元、恢复神经元功能而发挥对PD 的治疗作用。此外，由于百可利在模拟PD 早期损伤的模型中的疗效更突出，提示临床上对PD 的治疗应尽早用药，延缓疾病的进展。
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