现代医学研究表明，血管内皮胰岛素抵抗是糖尿病发生血管并发症的始动环节，是滋生多种代谢相关疾病的共同“土壤” ^{[1, 2]}。但目前，国内外对其发病机制尚不完全清楚。因此,阐明血管内皮IR发生的分子机制，发现糖尿病防治药物新的分子作用靶点及开发新的防治药物，对于降低糖尿病患者心脑血管事件发生，改善患者生存质量具有重要意义。PPARγ 是过氧化物增殖酶体激活受体超家族(PPARs) 的成员之一，是体内糖代谢和脂肪细胞分化的重要调节因子，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类的靶标^[3]，能改善血管内皮细胞对胰岛素的敏感性，机制可能与其激活了PPARγ依赖的胰岛素信号转导途径有关。另外，PPARγ也能在配体依赖方式下通过抑制其他转录因子，如NF-κB及活化剂蛋白-1家族，从而直接地抑制促炎症基因的表达^{[4, 5]}。研究证实前列腺素衍生物如15-脱氧前列腺素J2(15-d-PGJ2)是PPARγ的天然激动剂^{[6, 7]} 。

卡托普利(captopril，Cap)是第一代的血管紧张素转化酶抑制剂，临床广泛用于合并了糖尿病的高血压或心衰患者的治疗。有研究证实，Cap可通过增加前列腺素衍生物、缓激肽(bradykinin,BK)水平来改善IR^{[8, 9]}，那么，它能不能通过直接改变PPARγ的表达或活性来改善IR，目前相关报道甚少，因此，本实验探讨卡托普利改善内皮细胞胰岛素抵抗的机制，为寻找糖尿病血管病变防治的分子靶点拓展新的思路。

实验用HUVECs株购自美国ATCC(Catalog No: CRL-1730)；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培养基购自Gibco BRL公司。

NO检测试剂盒购自Beyotime Institute of Biotechnology；ET-1试剂盒购自上海RD生物公司；卡托普利购自上海普康公司；PPARγ抑制剂(GW9662)购自美国Sigma；PPARγ多克隆抗体购自美国Cell Signaling；PPARγ磷酸化抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；β-actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz；TRIzol 试剂购自Invitrogen公司；MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、Oligo(dT)15、Taq酶均购自Promega Corporation；引物购自上海捷瑞生物公司；其它各种化学试剂为进口或国产分析纯试剂。

将HUVECs均匀接种在六孔培养板上，随机分为5组，即Control组、IR组、IR+CapⅠ(1×10^-6 mol·L^-1 )组、IR+CapⅡ(1×10^-5 mol·L^-1 )组、IR+ CapⅢ(1×10^-4 mol·L^-1)组。除Control组(5.5 mmol·L^-1 葡萄糖的DMEM培养48 h)外，所有各组先用含33 mmol·L^-1葡萄糖的DMEM培养48 h，Cap各组再加不同浓度的Cap处理4 h，最后胰岛素(100 nmol·L^-1 )处理30 min，收集细胞上清液和细胞，分别进行指标检测。

IR的作用是由PPARγ介导 将HUVECs均匀接种在六孔培养板上，随机分为6组，即Control组、IR组、IR+CapⅡ(1.0×10^-5mol·L^-1 )组、PPARγ抑制剂GW9662(PI，1.0 μmol·L^-1 )组、IR+PPARγ抑制剂(IR+PI，1.0 μmol·L^-1 )组、IR+Cap(1.0×10^-5 mol·L^-1 )+ PPARγ抑制剂(IR+Cap+PI，1.0 μmol·L^-1 )组，除Control组和PI组(5.5 mmol·L^-1 葡萄糖的DMEM培养48 h)外，所有各组先用含33 mmol·L^-1葡萄糖的DMEM培养48 h，Cap各组再加不同浓度的Cap处理4 h，最后胰岛素(100 nmol·L^-1 )处理30 min，抑制剂组再加抑制剂GW9662(1.0 μmol·L^-1 )处理1 h，收集细胞上清液和细胞，分别进行以下指标检测。

(a) 参照碧云天生物技术研究所一氧化氮检测试剂盒的使用说明，先做出标准曲线，然后根据各组吸光度，计算出各组NO的含量。(b) 参照人内皮素(ET)酶联免疫试剂盒的使用说明，先做出标准曲线，然后根据各组吸光度，计算出各组ET-1的含量。

细胞经实验因素处理后，经PBS清洗后，用RIPA裂解液进行裂解，蛋白浓度用BCA试剂盒进行测定，细胞裂解物溶于上样缓冲溶液煮沸后经10%的SDS-PAGE电泳分离，并电转到PVDF膜上，取出后将膜放入质量浓度均为50 g·L^-1的脱脂牛奶或者BSA中封闭2 h，再用TBST洗膜3次，每次15 min。将膜放入一抗中(1 ∶ 750)，4℃孵育过夜。TBST冲洗膜后，将膜放入相应的二抗(1 ∶ 2 000)中，室温平摇2 h后，漂洗3次，每次20 min，用ECL化学发光法进行检测。将曝光条带进行X光胶片扫描后，在医学图形分析系统ImageTool软件上进行分析，将所得PPARγ蛋白带的综合密度分别除以对应组β-actin的综合密度后，Excel表中进行分析。

PCR扩增所用引物由上海生物工程有限公司合成，PPARγ上游引物：5′-TCTGGCCACCAACTTTGGG-3′；下游引物：5′-CTTCACAAGCATGAACTCCA-3′，PCR扩增片段长度为360 bp。内参β-actin上游引物：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；下游引物：5′-TGGAAGGTGG ACAGCGAGG-3′ ，PCR扩增片段长度为268 bp。PCR扩增体系为25 μL，其中cDNA为5 μL，上、下游引物各1.0 μL，2X Tag酶为12.5 μL，再用无菌三蒸水补至25.0 μL。PCR循环参数为30，94℃预变性5 min，94℃变性45 s，扩增PPARγ为61℃退火30 s，扩增β-actin 为55℃退火45 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min。取扩增产物6 μL上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在透射紫外光分析仪下摄影，并在电脑上用Image Tool图像处理软件进行处理。

各实验组数据以x±s表示，采用统计软件SPSS12进行方差齐性检验、单因素方差分析，组间比较用LSD法。

血管内皮IR评价指标常用血清或培养上清液中NO 和ET-1水平来表示。IR组与Control组比较，NO水平明显降低、ET-1水平明显升高(P<0.01 vs Control)；用低剂量的卡托普利处理4 h后，与IR相比NO水平明显升高且差异有显著性(P<0.05 vs IR)，而ET-1水平与IR组比较组间差异没有统计学意义(P>0.05)；中、高剂量的卡托普利处理后，NO升高更明显(P<0.01 vs IR)，ET-1水平明显降低(P<0.05)，见Fig 1。

Fig 1 NO,ET-1 levels of various treatments in cultured HUVECs (x±s,n=6) **P<0.01 vs control group; #P<0.05,##P<0.01 vs IR group

图选项

见Fig 2。PI组与Control组比较，NO、ET-1水平无明显差异(P>0.05)；IR+PI组与IR组比较，NO、ET-1水平差异也无统计学意义(P>0.05)；IR+Cap组与IR组相比NO水平明显升 高、ET-1水平明显下降(P<0.01)；而IR+Cap+PI组与IR+Cap组相比NO水平明显下降、ET-1水平明显升高(P<0.01)。

Fig 2 NO,ET-1 levels of various treatments in cultured HUVECs (x±s,n=6) **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs IR group; △△P<0.01 vs IR+Cap group

图选项

PPARγ mRNA各组样本均由对应的β-actin条带的扫描值标化再与Control组比较。PPARγ mRNA在正常HUVECs中呈基础性表达；HUVECs暴露在高糖培养液中48 h后，PPARγ mRNA的表达与Control组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Cap组中内皮细胞的PPARγ mRNA的表达量与IR组相比组间无明显差异(P>0.05)，见Fig 3。

Fig 3 Effect of various treatments on expression levels of PPARγ mRNA of HUVECs (x±s,n=6) The left panel shows a representative electrophoretic diagram for PPARγ,β-actin mRNA by agrose gels; the right panel shows a statistical diagram of grey density

图选项

PPARγ各组样本均由对应的β-actin条带的扫描值标化。PPARγ蛋白、P-PPARγ蛋白在正常HUVECs中呈基础性表达。IR组中PPARγ蛋白、P-PPARγ蛋白表达量无明显变化，与 Control组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；Cap组中内皮细胞的PPARγ 蛋白的表达量与IR组相比亦无明显差异(P>0.05)；而低、中剂量Cap组中内皮细胞的P-PPARγ 蛋白的表达量较IR明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；而高剂量Cap组与IR组相比P-PPARγ蛋白的表达无明显差异(P>0.05)，见Fig 4。

Fig 4 Effect of various treatments on expression levels of PPARγ and P-PPARγ in cultured HUVECs (x±s,n=6) The upper panel shows representative Western blot for PPARγ,P-PPARγ and β-actin; the lower panel shows a statistical diagram of grey density. #P<0.05 vs IR group.

图选项

卡托普利可以改善胰岛素抵抗，已有大量的资料证实。可能的作用机制目前有以下几个方面：通过扩血管效应，增加骨骼肌的血流，可促使葡萄糖和胰岛素向胰岛素敏感组织释放， 增加葡萄糖的利用；通过改善胰腺的血液循环从而提高胰岛β细胞的代谢，促进胰岛素分泌，加强靶细胞功能，提高胰岛素的生物效应，改善胰岛素抵抗^{[10, 11]}；Captopril还能通过抑制血管紧张素转换酶活性，使组织内BK降解减少，局部血管BK浓度增高，BK具有扩张血管和降压作用，BK是血管内皮L-精氨酸-NO途径的重要激活剂，它作用于内皮的β₂受体能引起血管内皮超极化因子及NO的释放，BK降解减少还能进一步促进15-d-PGJ2合成，而15-d-PGJ2是PPARγ的天然激动剂。

在我们的前期工作中，从整体动物、细胞和分子水平观察了PPARγ经典配体如罗格列酮(RG)或匹格列酮(PG)对高糖诱导血管内皮胰岛素抵抗的作用，探讨了其可能的作用机制。结果表明，无论RG或PG预处理和后处理，PG和RG均能明显改善HG诱导HUVEC胰岛素抵抗，其机制是通过非经典PPARγ依赖的NF-κB转录抑制途径(under revision)。PPARγ表达很广泛，包括脂肪细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞和心肌细胞等^[12] 。

本实验中，卡托普利改善胰岛素抵抗是否通过PPARγ来介导的目前机制还并不清楚。实验中用高糖(33 mmol·L^-1)处理内皮细胞48 h后再用胰岛素处理0.5 h，取其细胞上清测NO和ET-1水平，发现其NO水平比正常组明显下降，且差异具有统计学意义；ET-1水平明显升高，且差异具有统计学意义。证明胰岛素抵抗的模型建立成功。胰岛素抵抗模型建立后，在预实验中，我们设计了卡托普利浓度梯度(10^-8~10^-2 mol·L^-1)，结果发现，浓度≤10^-7 mol·L^-1时，Cap对细胞活力和胰岛素抵抗程度均没有影响；而浓度≥10^-3 mol·L^-1时，细胞活 力明显下降，表现出明显地细胞毒性。因此，我们就选择了1.0×10^-5mol·L^-1的浓度。用Cap处理4 h后，其NO水平比IR组明显升高，ET-1水平比IR组明显降低，PPARγ蛋白表达水平与IR组相比无明显改变，但P-PPARγ蛋白表达水平比IR组升高。结合文献资料可能存在机制：在高糖和胰岛素的刺激下，内皮细胞受损，导致NO的分泌减少，ET-1的分泌增多，而这两类物质动态平衡维持着血管的正常状态和功能。用Cap处理4 h后，Cap可以使内皮细胞内BK的减少，进而促进15-d-PGJ2的生成，15-d-PGJ2是PPARγ的天然激动剂，可以使PPARγ磷酸化途径被激活，进而改善胰岛素抵抗。

综上所述，卡托普利可以促使P-PPARγ蛋白的表达上调，PPARγ与胰岛素信号之间亦存在着正反馈机制；PPARγ可通过转录激活作用增加靶基因的表达或激活来发挥作用。活化的PPARγ能抑制脂肪细胞表达肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，减轻TNF-α诱发的胰岛素抵抗，且通过增加c-CBL相关蛋白及胰岛素受体底物2的表达，增强胰岛素的信号转导，从而改善胰岛素抵抗。