2. 临床药理学教研室, 江苏 徐州 221004;
3. 中药教研室, 江苏 徐州 221004
2. Dept of Clinical Pharmacology, Xuzhou Medical College, Xuzhou Jiangsu 221004, China;
3. Dept of Traditional Chinese Medicine, Xuzhou Medical College, Xuzhou Jiangsu 221004, China
糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的慢性并发症之一，其中心肌纤维化在糖尿病性心肌病的发生发展中起着重要的作用[1]。机体的高糖环境是糖尿病性心肌病的始动因素[2]，其病理学表现为心脏成纤维细胞数量的增加，心肌间质中胶原沉积增多、各型比例失调和排列紊乱，其中主要是collagen Ⅰ和collage Ⅲ明显增多[3,4]。
大黄为蓼科多年生草本植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根及根茎，其主要活性成分是蒽醌类衍生物。其中，游离的羟基蒽醌类化合物有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等。近年来研究发现，大黄游离蒽醌具有治疗糖尿病肾病的作用[5, 6, 7, 8]。然而大黄游离蒽醌对糖尿病大鼠心肌间质纤维化的影响鲜见报道，本实验通过链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型，观察大黄游离蒽醌对DCM心肌间质纤维化的影响，并探讨其减轻DCM心肌间质纤维化的机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物健康SD大鼠30只，♂，体质量(250±20) g，SPF级，购自徐州医学院实验动物中心，使用许可证号：SYXK(苏)2010-0011。
1.2 药品与仪器链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，批号：wxbb2432v)；大黄游离蒽醌(南京泽朗医药科技有限公司，批号：ZL20140522DH)；超敏兔两步法检测试剂盒(北京中杉金桥，批号：K142716D)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥，批号：K146909E)；兔抗CTGF 多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司，批号：941246)；大鼠I型胶原酶联免疫分析试剂盒(美国R &B公司，批号：201409)；大鼠Ⅲ型胶原酶联免疫分析试剂盒(美国R &B公司，批号：201408)；Masson三色染色液(上海源叶生物科技有限公司)；CTGF、procollagen I、collagen Ⅲ及β-actin引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)。One Touch 血糖仪(美国强生医疗器材有限公司)；BX43F型正置荧光显微镜(日本Olympus公司)；GL2200Pro型凝胶成像系统(美国Carestream公司)。
1.3 分组与给药♂SD大鼠30只，随机分为正常对照组(CON组，8只)和造模组(22只)，造模组腹腔注射60 mg·kg-1 STZ，正常对照组注射等体积的枸橼酸缓冲液。注射后72 h尾静脉测定空腹血糖，血糖 ≥ 16.7 mmol·L-1且稳定2周者为造模成功，共16只。将成模大鼠随机分为糖尿病心肌病模型组(DCM组，8只)及大黄游离蒽醌组(FAR组，8只)。每日上午9 ∶ 00时灌胃给药1次，大黄游离蒽醌于质量分数为1%的羧甲基纤维素钠中配成混悬液，给药剂量为50 mg·kg-1，正常对照组和糖尿病心肌病模型组给予等体积的羧甲基纤维素钠灌胃，连续给药8周。
1.4 观察指标 1.4.1 血糖测定干预8周后，禁食不禁水8 h，经尾静脉测空腹血糖。
1.4.2 心脏质量指数的测定处死大鼠前称量大鼠的体重；乙醚麻醉大鼠，迅速取出心脏，冰盐水冲洗，滤纸吸干，称量心脏质量，计算心脏质量指数(心脏质量/体质量，mg/g)。
1.4.3 心肌组织Masson染色取左心室心肌组织，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制作切片，连续切片(厚 4 μm)，每5张取1张，每个标本取3张切片。脱蜡后行Masson染色，光镜下观察心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝绿色，每张切片在400倍光学显微镜下观察并随机选取4个视野拍照，用Image-Pro Plus 5.0 图像处理系统测量胶原纤维阳性区占所观察视野的面积比。
1.4.4 RT-PCR法检测心肌组织中CTGF、procollagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA表达于-80 ℃ 冰箱取出心肌组织，按TRIzol试剂说明书方法提取心肌组织总RNA。取1 μg进行RT-PCR反应。所用 RT-PCR扩增引物见Tab 1(β-actin为内参照)。每个前胶原蛋白分子的N端和C端分别含有1个前肽，成熟时前胶原蛋白分子经胞吐作用被分泌至细胞外，受前胶原肽酶的作用，去除N端和C端的前肽，形成胶原。因此，collagen I的表达水平可以用心肌组织Ⅰ型前胶原蛋白(procollagen Ⅰ)水平表示。CTGF及β-actin变性、退火和延伸温度分别为94 ℃、60 ℃、72 ℃，反应时间分别为30、30、60 s；procollagen Ⅰ及collagen Ⅲ变性、退火和延伸温度分别为94 ℃、55 ℃、72 ℃，反应时间分别为30、30、60(30 s)，共40个循环。循环完毕再72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，用GL2200Pro型凝胶成像系统对每一标本的PCR产物扩增的特异性片段进行灰度扫描，用CTGF、procollagen Ⅰ及collagen Ⅲ的灰度值与β-actin的比值表示目的基因CTGF、procollagen Ⅰ及collagen Ⅲ的相对表达量。
| Name | Primer sequence | Product |
| Procollagen Ⅰ | Sense:5’-TTCACCTACAGCACGCTTGT-3’ | 196bp |
| Antisense:5’-TTGGGATGGAGGGAGTTTAC-3’ | ||
| Collagen Ⅲ | Sense:5′-TGGTCCTCAGGGTGTAAAGG-3′ | 232bp |
| Antisense: 5′-GTCCAGCATCACCTTTTGG-3′ | ||
| CTGF | Sense: 5’-GCTAAGACCTGTGGAATGGGC-3’ | 383bp |
| Antisense: 5’-CTCAAAGATGTCATTGCCCCC-3’ | ||
| β-actin | Sense:5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’ | 432bp |
| Antisense: 5’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’ |
取左心室常规石蜡包块制作切片，连续切片(厚4 μm)，每5张取1张，每个标本取3张切片。采用免疫组织化学法检测心肌组织中CTGF含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。抗体按1 ∶ 100 的方法稀释，以 PBS 替代一抗作为阴性对照，将切片置于200倍光学显微镜下观察并随机选取4个视野拍照，阳性区出现棕黄色颗粒，用Image-Pro Plus 5.0 图像处理系统测量CTGF的平均积分吸光度。
1.4.6 ELISA法检测心肌组织collagen Ⅰ和collagen Ⅲ胶原含量采用ELISA法检测心肌组织中CTGF含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.5 统计学分析数据均以x±s表示，采用SPSS 16.0统计软件处理。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。
2 结果 2.1 大鼠空腹血糖和心脏质量指数与CON组相比，DCM组大鼠心脏质量指数升高(P>0.01)。与DCM组相比，FAR组心脏质量指数下降(P>0.01)。表明糖尿病大鼠已出现心肌肥厚，大黄游离蒽醌可减轻糖尿病所致心肌肥厚(Tab 2)。
各组心肌组织Masson染色，见Fig 1。CON组大鼠左心室心肌间血管和心肌间质可见少许胶原纤维沉积。DCM大鼠的胶原纤维沉积更加明显。FAR组胶原沉积有所减轻。用Image-Pro Plus 5.0 图像处理系统测量胶原纤维阳性区占所观察视野的面积比。结果发现：与CON组相比，DCM组大鼠心肌间质胶原纤维明显增多(P>0.01)；与DCM比，FAR组大鼠心肌间质胶原纤维明显减少(P>0.05)。
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| Fig.1 Effects of FAR on myocardial fibrosis in diabetic rats (×400,x±s,n=6) **P>0.01 vs CON group; #P>0.05 vs DCM group. |
与CON组相比，DCM组大鼠心肌组织CTGF、procollagen I和collagen Ⅲ mRNA表达均明显升高(P>0.05)；与DCM相比较，FAR组大鼠心肌组织CTGF、procollagen I和collagen Ⅲ mRNA表达均明显降低(P>0.05)，说明FAR有抑制CTGF、procollagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA表达的作用，见Fig 2。
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| Fig.2 Effects of FAR on expressions of CTGF,procollagen Ⅰ and collagen Ⅲ mRNA in myocardial tissues of diabetic rats (x±s,n=6) *P>0.05 vs CON group; #P>0.05 vs DCM group. |
CON组大鼠左心室心肌组织CTGF低表达，阳性颗粒散在，染色较浅；DCM组高表达，棕黄色信号强，融合成片，而FAR组表达明显降低，见Fig 3。用Image-Pro Plus 5.0 图像处理系统分别测量每张切片CTGF的平均积分吸光度，结果如下：与CON组相比，CTGF的表达在DCM组中明显升高(P>0.05)；与DCM组相比，FAR组的CTGF表达明显降低(P>0.05)。
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| Fig.3 Effects of FAR on expression of CTGF protein in myocardial tissues of diabetic rats (×200,x±s,n=6) *P>0.05 vs CON group; #P>0.05 vs DCM group. |
与CON组相比，DCM组的collagen Ⅰ及collagen Ⅲ的含量增加(P>0.01)；与DCM 组相比，FAR组的collagen Ⅰ及collagen Ⅲ的含量有所下降，见Fig 4。
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| Fig.4 Effects of FAR on depositions of collagen type I and collagen type Ⅲ in myocardial tissues of diabetic rats (x±s,n=6) **P>0.01 vs CON group; #P>0.05,##P>0.01 vs DCM group. |
糖尿病性心肌病是糖尿病常见的并发症之一，以舒张功能不全为早期临床表现，晚期以收缩功能 障碍为主[9, 10]，最终可导致心力衰竭。有研究表明，左心室舒张功能降低、泵血功能异常与其心肌间质纤维化有关[4, 11]。正常心肌细胞外基质中的胶原主要为I型及Ⅲ型，I型约占心肌胶原总数的80%，纤维粗，有较大的僵硬度和很强的抗牵拉特性而用于保持室壁的强度；Ⅲ型胶原约占11%，纤维较细，伸展性和弹性大，与室壁弹性有关。异常增多且比例失调的胶原纤维使心室壁的顺应性下降，僵硬度增加，舒张期充盈受限；如果心肌纤维化进一步加重，势必损害心肌的收缩功能[12]。
CTGF是一类能够调节机体有关组织生长的细胞因子。CTGF基因属即刻早期基因，启动子含转化生长因子TGF-β应答元件，可被TGF-β选择性诱导激活，它通过促进细胞增殖，直接诱导胶原生成，促进细胞黏附等自身的生物学效应参与纤维化的发生与发展，因此CTGF是检测体内纤维化的有效指标[13, 14, 15, 16]。
我们研究证实糖尿病大鼠心肌纤维化同时伴随CTGF的高表达，与Way等[17]和Hagendomm等[18]研究一致。在本实验中，Masson 染色示糖尿病大鼠心肌间质纤维增生，心肌组织中procollagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA表达明显增强，Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维的含量亦明显升高，提示糖尿病大鼠已存在心肌纤维化。大黄游离蒽醌干预8周后，糖尿病大鼠心肌纤维化程度有所改善，心肌CTGF、Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维的表达亦明显减少，提示大黄游离蒽醌的抗心肌纤维化可能与抑制CTGF的表达进而减少Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维的合成有关。
综上所述，糖尿病心肌纤维化与心肌CTGF过度表达有关，FAR可通过下调糖尿病大鼠心肌组织CTGF的表达，减少心肌间质中collagen Ⅰ和Ⅲ 合成及沉积，从而改善糖尿病心肌病大鼠早期的心肌纤维化。
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