应激是指机体在受到内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应，其主要特征是以下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA)的激活为核心的生理和心理反应。促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)是下丘脑分泌的调节HPA轴功能的多肽类激素，也是机体应激反应时发挥神经内分泌调节的关键激素^[1]。近年来发现，CRH不仅在HPA轴调节中起着重要作用，作为一种神经递质，其在情绪反应、学习记忆和神经系统损伤与发育中也发挥着重要作用^[2]。我们前期的研究发现，一定浓度的CRH可以降低海马神经元细胞存活率，并且呈现出浓度和时间依赖模式^[3]。CRH通过其受体发挥生物学作用，CRH受体1(CRH-R1)主要表达于哺乳动物的中枢神经系统中，如下丘脑、海马、大脑皮层、杏仁体、蓝斑等部位，与CRH有较高的亲和力^[4]。在应激状态下，CRH主要通过CRH-R1发挥内分泌、行为改变和内脏反应等功能的调节作用^{[5, 6, 7]}，但有关CRH-R1发挥作用的方式尚不清楚。本实验应用CRH-R1拮抗剂CP154526，重点探讨其对海马神经元凋亡的影响，以期明确CRH-R1在CRH诱导神经元凋亡中的作用，为应激所致精神损伤的防治提供一定的理论依据。

新生24 h内SD大鼠，♂♀不限，由河北医科大学实验动物中心提供。

DMEM培养基(Gibco)、胎牛血清(Cellgro)、Neurobasal培养基(Gibco)、B27(PAA)。CRH(Anaspec)，CP154526(Tocris Bioscience，Bristol)，0.25%胰蛋白酶(Sigma)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma)。兔抗MAP2一抗(Cell Signaling)，兔抗Bax、Bcl-2多克隆抗体(Protein Tech)，鼠抗caspase3单克隆抗体(Cell Signaling)，FITC标记的IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。TUNEL试剂盒(Roche)。Annexin Ⅴ/PI凋亡检测试剂盒(联科生物)。

新生24 h内SD乳鼠，75%乙醇消毒，无菌条件下断头、取双侧海马，解剖显微镜下去除血管及脑膜，剪碎后以0.125%胰蛋白酶消化15 min，含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1 mm口径吸管吹打均匀，细胞计数，稀释成1×10⁶ ml^-1的细胞悬液，接种于6孔培养板(预先经0.1%多聚赖氨酸铺底)，将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱内，3 h后补种植液，24 h后去除种植液，加入培养液(Neurobasal+B27)培养，每3 d换液，培养6~8 d神经细胞之间突触联成网状用于后续研究^[8]。

取培养7 d海马神经元，70%酒精固定30 min，0.1%Triton 37℃孵育15 min，3%H₂O₂去除内源性过氧化物酶，山羊血清封闭30 min，兔抗MAP2一抗1 ∶ 200稀释，4℃过夜，FITC标记的山羊抗兔二抗37℃孵育2 h，PBS冲洗，甘油封片，荧光显微镜观察结果。

细胞悬液200 μL接种于96孔培养板中，加入不同浓度的CRH(10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol·L^-1)作用48 h后，每孔加5 g·L^-1 MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h后小心吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl-sulfoxide,DMSO)振荡10 min，490 nm波长测定各孔吸光度值(A值)，计算细胞存活率。存活率/%=实验组A值/空白对照组A值×100%。实验重复3次，找到诱导海马神经元存活率降低的CRH的最低敏感浓度。

用神经元培养液将CRH受体1特异性拮抗剂CP154526稀释至10、50、250 mmol·L^-1的终浓度，与CRH共同刺激海马神经元48 h，上述同样方法检测神经元存活率，找到CP154526的最低敏感浓度。

后续实验分为4组：(1)空白对照组：神经元培养液正常培养；(2)CRH组：用MTT结果中CRH诱导海马神经元凋亡的最低敏感浓度培养；(3)CRH+CP组：加入CRH同时加入CRH受体1拮抗剂CP154526；(4)CP组：只加入CP154526培养。各组培养液量一致，均培养48 h。

以末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法，按试剂盒说明进行细胞凋亡检测，DAPI复染细胞核。凋亡神经元细胞核呈绿色荧光。每张切片于凋亡细胞分布区域随机选取10个高倍视野，计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，以百分数(%)表示凋亡百分率。

用0.25%胰蛋白酶制备单细胞悬液，用膜联蛋白V (Annexin V) / 碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染色标记法进行流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。

收集各组细胞提取总蛋白，每组样品取50 μg总蛋白，加6×上样缓冲液，100℃变性5 min，经10% SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，加入一抗Bax(1 ∶ 1 000)、Bcl-2(1 ∶ 200)、caspase-3(1 ∶ 1 000)和β-actin(1 ∶ 1 000)，4℃孵育过夜。TTBS洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠IgG(1:5000)，37℃孵育2 h，TTBS洗膜，滴加ECL发光剂，于Odyssey FC成像系统中显影，并对条带进行定量分析。以目的条带和β-actin条带积分光密度值比值作为最终结果。

采用SPSS统计软件进行统计学分析，数据用表示，各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，用最小显著差异法(least significant difference,LSD)作两两比较。

倒置显微镜下可见，原代培养海马神经元7 d时神经元胞体丰满，周围光晕明显，立体感强，突起增粗增长，连接成网状(Fig 1A)，显示神经元成熟。Fig 1B所示为神经元特异性标志物MAP2免疫荧光染色，可见神经元胞体和突起着色，经鉴定神经元纯度在90%以上，可用于后续实验研究。

Fig 1 Primary culture and immunofluorescence identification of hippocampal neuron A: morphological characteristics of primary cultivated hippocampal neuron(×200); B: the immunofluorescence identification of hippocampal neuron (×200).

图选项

以正常对照组细胞存活率为100%计算，不同浓度的CRH刺激海马神经元后，随着浓度的增大，细胞存活率呈下降趋势；与正常对照组相比，浓度为10^-8 mol·L^-1的CRH刺激后，细胞存活率降低即具有统计学意义(P<0.05，Fig 2A)，故CRH导致神经元存活率降低的最低敏感浓度为10^-8 mol·L^-1。

Fig 2 Cell viability assayed by MTT *P<0.05,**P<0.01 vs control; #P<0.05 vs CRH.

图选项

将不同浓度的CRH受体1特异性拮抗剂CP154526分别加入10^-8 mol·L^-1CRH刺激的神经元培养基中，可见，随着浓度的增大，细胞存活率有所升高，与CRH组相比，50 mmol·L^-1的CP154526可明显提升神经元存活率(P<0.05，Fig 2B)。

TUNEL染色可见，与正常对照组相比，10^-8 mol·L^-1的CRH刺激后凋亡细胞明显增加(P<0.05)，加用50 mmol·L^-1的CP154526后，凋亡细胞明显减少(P<0.05)。单独应用CP154526，和正常对照组相比，凋亡细胞没有明显变化，见Fig 3。

Fig 3 Neuron apoptotic rates of different groups examined by TUNEL (CRH: 10-8 mol·L-1; CP154526: 50 mmol·L-1) *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs CRH.

图选项

Annexin Ⅴ是检测细胞早期凋亡的敏感指标之一。流式细胞仪将收集到的细胞分为四个象限，左下象限代表的是活细胞，右下象限代表的是早期凋亡细胞，右上象限代表的是晚期凋亡细胞。早期凋亡和晚期凋亡比率之和作为总的凋亡率。如Fig 4所示，与正常对照组相比，CRH刺激后神经元凋亡率明显增加(P<0.05)；加用CP154526后，凋亡率明显降低(P<0.05)；而单独应用CP154526，与正常对照组相比，神经元细胞凋亡率没有明显变化(P>0.05)。

Fig 4 Neuron apoptotic rates of different groups examined by Annexin V/PI (CRH: 10-8 mol·L-1; CP154526: 50 mmol·L-1) *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs CRH.

图选项

与正常对照组相比，CRH 刺激后，凋亡标志蛋白Bax表达增加，Bcl-2表达降低，Bax/Bcl-2比值明显升高(P<0.05)；caspase-3蛋白表达增加(P<0.05)。加用CP154526后，Bax/Bcl-2比值明显降低(P<0.05)；caspase-3表达也明显降低(P<0.05)。而单独应用CP154526，Bax/Bcl-2比值和Caspase-3蛋白水平与对照组相比均无统计学意义(P>0.05),见Fig 5。

Fig 5 Protein expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in different groups examined by Western blot (CRH: 10-8 mol·L-1; CP154526: 50 mmol·L-1) *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs CRH.

图选项

应激反应中，HPA轴激活的中枢控制是十分复杂的，在这一系列神经内分泌调节过程中，下丘脑合成和释放的CRH起着关键作用，它控制着HPA轴的兴奋水平。随着对应激反应研究的深入，发现CRH还是一种重要的神经递质，在情绪反应、学习记忆和神经系统损伤与发育中也有着重要作用^[2]。

海马是边缘系统的重要组成部分，是HPA轴应激反应的高位调节中枢，参与了情绪、学习和记忆、行为、免疫等的调节，对应激反应非常敏感且易损，它的损伤在各种应激所致疾患中起到关键作用。研究表明，慢性应激可能通过增加海马神经元细胞凋亡，导致海马损害，从而诱发抑郁症^{[9, 10]}。因为位于海马CA1区的锥体细胞表达糖皮质激素受体，而应激状态下，肾上腺分泌的糖皮质激素可以通过血脑屏障作用于这些受体，因此，很多学者认为糖皮质激素及其受体介导应激对海马功能产生影响^[11]。但是，当肾上腺切除后，慢性应激一样可以影响海马功能。越来越多的研究结果显示，CRH及其受体参与介导应激对海马结构和功能产生影响^[12]。

目前已知的CRH受体有3种，即CRH-R1、CRH-R2和CRH-R3，均属于G蛋白偶联受体。3种受体的功能及与CRH的亲和力不尽相同。其中CRH-R1由415~420个氨基酸组成，与CRH有较高的亲和力。CRH-R1 mRNA主要表达于哺乳动物的中枢神经系统中，如下丘脑、海马、大脑皮层、杏仁体、蓝斑等部位，在外周的表达极其有限^[4]。大量研究表明，在应激状态下，CRH主要通过CRH-R1发挥内分泌、行为改变和内脏反应等功能的调节作用^{[5, 6, 7]}。CRH-R2序列与CHR-R1有约70%的同源性，其在中枢神经系统表达有限，而在外周主要表达在心肌、骨骼肌、胃肠道等部位^[13]。CRH-R3最早于2001年被分离出来，由428个氨基酸序列组成，但有关其分布、特性及作用尚不清楚^[14]。

关于CRH受体在应激中的作用，有研究报道，应用CRH-R1基因敲除鼠，基础和应激状态下HPA轴功能明显受损。而边缘系统CRH-R1对调控应激时HPA轴反应至关重要^[15]。我们前期研究发现，一定浓度的CRH可以降低海马神经元细胞存活率，但CRH的作用是否是通过其受体1来发挥的，及其具体的作用机制尚不清楚。本实验中，我们应用TUNEL、流式Annexin Ⅴ-PI双标染色、Western blot等方法进一步证实，CRH可以导致体外原代培养的大鼠海马神经元细胞凋亡增加，应用CRH-R1特异性拮抗剂CP154526可以有效的降低神经元凋亡率，说明CRH-R1确实在CRH诱导神经元凋亡的过程中发挥了重要作用。

关于CP154526降低神经元凋亡的可能原因，目前尚无明确报道。我们考虑，可能与CP154526高度亲脂性及其半衰期较长有关，使得CP154526可与CRH-R1充分结合，从而抑制了CRH的作用。当然，细胞内调控凋亡的信号系统精细复杂，CP154526具体是如何发挥其调控作用的将是我们下一步研究的重点。

上述实验结果说明，应激状态下，一定浓度的CRH可通过其受体1诱导神经元细胞凋亡，而CP154526对神经细胞的凋亡具有一定的抑制作用，可为应激所致精神损伤的细胞保护治疗提供新的思路。