脑缺血损伤引发缺血半暗带区神经细胞凋亡[1]。早期研究证实，脑缺血损伤后脑组织处于低氧环境中，神经细胞损伤表现为坏死或凋亡，细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路的激活能够促进细胞的增殖、分化与修复，减轻神经细胞损伤[2, 3]。但后来实验证明，ERK1/2通路在脑缺血损伤中能够促进炎症反应、介导神经细胞凋亡[4]。ERK1/2通路抑制剂和钙通道阻滞剂氯胺酮可抑制脑缺血大鼠ERK1/2通路的激活，下调miRNA-21和MMP-9表达，降低炎症反应，保护血脑屏障损伤，减轻脑水肿[5]。本课题组研究证明，胡黄连苷Ⅱ在脑缺血损伤的多个环节中发挥作用，具有抗氧化、抗炎、减轻脑水肿、抑制神经细胞凋亡的作用[6, 7, 8, 9, 10]，但细胞的形态结构依然是评价神经系统损伤和修复程度的可靠指标。因此，本实验研究胡黄连苷Ⅱ对脑缺血损伤后神经细胞凋亡及其超微结构的影响，进一步验证黄连苷Ⅱ对脑缺血损伤的保护作用。
1 材料与方法 1.1 动物模型成年健康♂ Wistar大鼠60只，体质量220~250 g，SPF级，青岛市药品检验所实验动物中心提供[SCXK(鲁)20100010]。实验前将动物置于实验室适应环境，饲养7 d，自由进食、饮水，室温(25±2)℃，自然光照。随机选择15只大鼠作为对照组，其余45只大鼠运用线栓法[11]经左侧颈外-颈内动脉插线建立大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。术前12 h禁食，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉动物，仰卧位固定，无菌操作。大鼠术后2 h应用改良神经功能评分(mNSS)[12]法评分，将评分为7~12分的大鼠视为成功模型纳入实验，不符合标准和术后2 h死亡的15只动物剔除。将成功的30只动物模型随机分为模型组和治疗组，每组15只，对照组动物除不插线进入颅内外，余操作同实验组。
1.2 干预措施用生理盐水将胡黄连苷Ⅱ(CAS No：39012-20-9，纯度>98%，分子量：512，天津奎青有限公司)配制成10 g·L-1的溶液，治疗组大鼠在缺血后2 h腹腔注射胡黄连苷Ⅱ(20 mg·kg-1)[13, 14]，模型组和对照组同步腹腔注射等体积的生理盐水。
1.3 评价指标 1.3.1 行为测试治疗前和治疗后24 h，应用mNSS法评定动物的神经行为功能，0~18分，评分越高说明动物神经行为功能损伤越重，反之则较轻微。
1.3.2 TTC染色治疗后24 h，每组随机选取5只动物，经心脏灌注生理盐水200 mL取脑，利用大鼠切脑模具由前向后连续冠状切片，每片厚2 mm，共计5片，置20 g·L-1的氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液中浸泡 10 min，37℃避光，正常脑组织呈均匀红色，梗死组织呈白色，拍照。应用Adobe PhotoShop CS测量脑梗死体积，脑梗死体积(cerebral infract volume,CIV)=经过视交叉平面的脑梗死面积/该层同侧半球面积。
1.3.3 HE染色治疗后24 h，每组随机选取5只动物，经心脏灌注4%多聚甲醛溶液200 mL取脑，切取缺血部位脑组织置4%多聚甲醛溶液后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。常规脱水、透明、包埋，连续冠状位切片，厚度为5 μm，贴于防脱载玻片上，4℃保存。石蜡切片常规脱蜡水化，苏木精染色5 min，1％盐酸酒精分色20 s，l％氨水返蓝30 s，伊红染色5 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜(Leica DMI4000B，德国)下观察，神经细胞核呈蓝色，细胞质呈不同程度的红色。在400倍显微镜下，每张切片随机观察皮质区4个不重叠的视野计数细胞，取其均值。以变性细胞指数(denatured cell index，DCI)=变性细胞数/细胞总数表示损伤程度。
1.3.4 电镜观察从上述动物缺血皮质区取少量脑组织，切成1 mm×1 mm×1 mm小块，置于2.5％戊二醛中固定24 h，0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(PBS)漂洗10 min×3次；锇酸后固定1 h，PBS漂洗10 min×3次，4℃冰箱过夜；梯度丙酮脱水，环氧树脂Epon812包埋。修块后应用超薄切片机(Leica EM UC6，德国)切成50 nm超薄切片，置于聚乙烯醇缩甲醛膜(Formvar膜)载网(铜网)上，4℃保存。预先配制3%醋酸铀饱和酒精溶液和6%枸橼酸铅染液。将1滴3%醋酸铀饱和酒精溶液(pH=3.5)滴在放有洁净蜡片的培养皿中，然后将带有切片的载网覆盖在染液上，使有切片的一面与染液接触，染色30 min，双蒸水洗涤切片10 min×3次，吸干水分，用同样方法6%枸橼酸铅染液(pH=12)染色5 min，去二氧化碳双蒸水冲洗10 min×3次，吸干水分，室温干燥，透射电镜(JEM-1200EX，日本)观察神经元的超微结构。
1.3.5 TUNEL染色石蜡切片常规脱蜡水化，按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(KGA7025-50assays，凯基生物公司)说明书预处理，促渗、封闭、通透、制备阳性片、POD标记、DAB显色和苏木精复染等。光镜下细胞核有棕色颗粒者为凋亡细胞。阴性对照样本不加TDT酶，不出现阳性着色。在400倍显微镜下，每张切片随机观察皮质区4个不重叠视野，计数细胞，取其均值。以凋亡细胞指数(apoptotic cell index，ACI)=凋亡细胞数/细胞总数，表示细胞凋亡程度。
1.3.6 免疫组化p-ERK1/2兔抗鼠单克隆一抗(1 ∶ 100，#4370)由Cell Signaling Technology公司提供，二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6001)由北京中杉金桥生物公司提供。石蜡切片常规脱蜡水化，阻断内源性过氧化物酶、柠檬酸盐缓冲液抗原修复、37℃一抗孵育60 min、室温二抗孵育60 min、DAB显色、苏木精复染、中性树胶封片。光镜下阳性细胞呈棕黄色。阴性对照切片以0.1 mol·L-1的PBS替代一抗孵育，无阳性细胞出现。在400倍显微镜下，每张切片随机观察皮质区4个不重叠视野，细胞计数，取其均值。以阳性细胞指数(positive cell index，PCI)=阳性细胞数/细胞总数，表示p-ERK1/2的表达强度。
1.3.7 Western blot治疗后24 h，每组取5只动物，切取缺血部位脑组织100 mg，按脑组织和细胞裂解液10 mg ∶ 100 μL的比例加入细胞裂解液(1 mL裂解液+10 μL PMSF，No. P0013B，碧云天生物技术研究所)1 mL，4℃冰浴中研磨，置于4℃摇床0.5~1 h充分裂解，4℃离心机(Eppendorf 5801型，德国)12 000 r·min-1离心15 min，去沉淀组织留上清液，BCA法测定蛋白浓度，最后加入SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)充分混匀，置95~97℃水浴中加热5 min，-80℃保存。取蛋白样品20 μg，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，半干法转膜(Bio-Rad公司)。将PVDF膜分别浸入含质量分数为10%的脱脂奶粉的TBST封闭液，室温封闭1 h，用质量分数5%BSA的TBST配制兔抗鼠p-ERK1/2单克隆抗体(1 ∶ 2 000)一抗稀释液，4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜10 min×3次，用质量分数为5%的脱脂奶粉的TBST配制HRP标记的羊抗兔二抗稀释液(1 ∶ 10 000,Ab136817，Abcam公司)室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。最后加入200 μL显影工作液混匀，化学发光多色荧光及活体成像系统(Vilber Fusion FX7，法国)曝光显影，Quantity one软件分析各条带灰度值。将PVDF膜浸入Restore Western Blot Stripping Buffer(21062，Thermo公司)中10min，洗去一抗二抗，再重复封闭、质量分数为5%BSA的兔抗鼠ERK1/2多克隆抗体(1 ∶ 1000,#9102，Cell Signal Technology,USA)TBST一抗稀释液4℃摇床孵育过夜、二抗室温孵育1 h，发光显影，测定各条带灰度值等步骤。计算目的蛋白相对值(relative value of protein，RVP)=p-ERK1/2灰度值/ERK1/2灰度值。重复测定5次，取其均数。
1.4 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析。多组间比较采用单因素方差分析及最小显著差数法(LSD)两两比较。
2 结果 2.1 神经行为功能缺损评分对照组大鼠活动正常，造模后动物表现不同程度的神经行为功能障碍。治疗前后自身比较，治疗组大鼠mNSS评分明显下降(t=5.17，P＜0.05)。治疗后治疗组大鼠mNSS评分较模型组明显降低(t=6.73，P＜0.05)。见Tab1。
,n=15)
TTC染色显示，对照组大鼠脑组织呈均匀红色，未见明显梗死灶。模型组大鼠脑组织可见大片白色梗死病灶(79.82±7.56)。治疗组大鼠脑梗死体积(65.32±6.90)较模型组明显缩小(t=3.88，P＜0.05)。见Fig1。
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| Fig 1 Cerebral infarct volume in each group by TTC staining (n=5) A: Control group; B: Model group; C: Treatment group. *P＜0.05 vs control group; #P＜0.05 vs model group |
HE染色显示，对照组大鼠皮质区神经细胞胞体较大，胞核呈嗜碱性蓝色，胞质呈嗜酸性紫红色，排列整齐，结构完整，着色均匀。模型组大鼠皮质区神经细胞排列紊乱，胞核固缩、着色加深，变性坏死后形成大量空泡，DCI(0.75±0.11)较对照组(0.10±0.07)明显升高(t=11.71，P＜0.05)。治疗组大鼠皮质区神经细胞损伤较模型组减轻，DCI(0.37±0.11)较模型组明显降低(t=6.91，P＜0.05)。见Fig2。
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| Fig 2 Morphology and structure of nerve cells in cortex in different groups (HE×400) A: Control group; B: Model group; C: Treatment group. →indicated denatured cells. *P＜0.05 vs control group; #P＜0.05 vs model group |
对照组大鼠皮质神经元轮廓清晰，核大而圆，染色质均匀，胞质清晰(Fig3A1)，高倍镜下双层核膜清晰完整，胞质内线粒体内外膜完整、内膜凹陷形成嵴，高尔基体扁平囊周围有数个大小不等的囊泡，溶酶体、内质网等细胞器散在分布、结构 完整(Fig3A2)。血管内皮细胞光滑平整，内皮细胞、基底膜以及胶质细胞足突细胞接触紧密(Fig4A1)；高倍镜下内皮细胞、基底膜以及胶质细胞足突细胞层次分明，连接紧密(Fig4A2)。模型组大鼠皮质神经元形状不规则，细胞核内染色质凝聚固缩，细胞质溶解，周围有空泡形成(Fig3B1)，高倍镜下细胞核内染色质凝聚，核膜溶解，胞质内细胞器溶解消失(Fig3B2)。血管周围胶质细胞溶解消失，管腔凹陷、内壁不平滑(Fig4B1)，高倍镜下内皮细胞肿胀，基底膜增厚，层次不清(Fig4B2)。治疗组大鼠神经元损伤较模型组有所减轻(Fig3C1~C2)。血管内皮细胞、基底膜平滑完整、层次清晰(Fig4C1~C2)。
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| Fig 3 Ultra-structure of neuron in cortex, EM×5k, 20k A: Control group; B: Model group; C: Treatment group; Nu: Nucleolus; Np: Nuclear pore; Nm: Nuclear membrane; Ch: Chromatin; Mi: Mitochondria; ER: Endoplasmic reticulum; Gb: Golgi complex; Ly: Lysosome; Vc: Vacuole |
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| Fig 4 A: Control Group; B: Model group; C: Treatment group; Bm: Basement membrane; Ec: Endothelial cell; Fp: Foot process; RBC: Red blood cell A: Control group; B: Model group; C: Treatment group; Nu: Nucleolus; Np: Nuclear pore; Nm: Nuclear membrane; Ch: Chromatin; Mi: Mitochondria; ER: Endoplasmic reticulum; Gb: Golgi complex; Ly: Lysosome; Vc: Vacuole |
TUNEL检测显示，对照组大鼠皮质区仅有少量凋亡细胞(ACI=0.11±0.07)；模型组大鼠皮质区凋亡细胞(ACI=0.59±0.10)较对照组明显增多(t=9.16，P＜0.05)，排列紊乱，胞体固缩，周围空隙增大；治疗组大鼠皮质区凋亡细胞(ACI=0.33±0.07)较模型组明显降低(t=5.03，P＜0.05)。见Fig5。
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| Fig 5 Apoptosis in cortex of rats TUNEL×400 A: Control group; B: Model group; C: Treatment group; →indicated apoptotic cells. *P＜0.05 vs control group; #P＜0.05 vs model group |
对照组大鼠神经细胞p-ERK1/2蛋白表达较弱(PCI=0.08±0.03)，着色较浅。模型组大鼠p-ERK1/2表达(PCI=0.54±0.11)明显高于对照组(t=8.47，P＜0.05)。治疗组大鼠p-ERK1/2蛋白表达(PCI=0.34±0.10)明显低于模型组(t=3.74，P＜0.05)。见Fig6。
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| Fig 6 p-ERK1/2 expression in cortex of rats (DAB×400) A: Control group; B: Model group; C: Treatment group. → indicated positive cells. *P＜0.05 vs control group; #P＜0.05 vs model group |
Western blot检测显示，MCAO造模后模型组大鼠皮质神经元p-ERK1/2蛋白表达(RVP=0.60±0.10)升高，明显高于其他两组(t=6.641、3.553，P＜0.05)。治疗组p-ERK1/2表达(RVP=0.38±0.08)较模型组有所降低，但仍高于对照组(RVP=0.19±0.11，t=3.087，P＜0.05)。见Fig7。
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| Fig 7 p-ERK1/2 and ERK1/2 expressions determined by Western blot A: Control Group; B: Model group; C: Treatment group. *P＜0.05 vs control group; #P＜0.05 vs model group |
急性缺血性脑中风发作的几分钟之内，脑缺血区血流量急剧减少，神经细胞受损，表现为坏死或凋亡，各种生长因子、氧化应激、细胞内Ca2+水平等信号激活，介导细胞增殖、分化、凋亡等生理过程[2]。实验证实[15]，ERK1/2通路可以介导细胞凋亡，具体机制主要分为细胞内途径和细胞外途径[1]。细胞内途径主要是某些特定的刺激引起的，其可导致线粒体细胞色素C的释放以及caspase-9等的激活[16]。细胞外途径主要是通过激活TNF-α、Fas、caspase-8等的受体来激活细胞内途径[17]。Namura等[18]实验证实，ERK1/2通路抑制剂U0126能够降低前脑缺血或者局灶性缺血模型沙鼠的脑梗死面积，保护神经系统，并且对缺氧环境中的原代皮质神经元细胞也表现出一定的保护作用。此外，有报道证实，ERK1/2的激活可以直接导致神经细胞的肿胀、坏死，而该过程独立于caspase家族的激活[19]。
本课题组前期研究显示，在脑缺血损伤中，中药胡黄连的主要活性成分胡黄连苷Ⅱ能够清除自由 基、抗氧化；通过下调MMP-9、AQP4蛋白的表达、抑制TLR4-NFκB信号传导通路，缓解脑水肿、改善大脑的神经功能[20]；下调caspase-3和PARP表达，抑制脑缺血/再灌注损伤诱导的细胞凋亡[6, 7, 8, 9, 10]；其治疗脑缺血的最佳时间和剂量为缺血后1.5~2 h腹腔注射10~20 mg·kg-1[21, 22]。本实验结果表明，脑缺血损伤后，皮质缺血区神经元ERK1/2激活而诱导细胞凋亡，脑梗死体积增大，神经元和血脑屏障结构损伤，动物出现神经行为功能障碍。经胡黄连苷Ⅱ干预后，缺血区神经细胞p-ERK1/2表达降低，凋亡数量减少，神经元和血脑屏障的超微结构损伤明显改善，脑梗死体积缩小，动物神经功能缺损评分减低。提示脑缺血损伤后介导神经细胞凋亡，而胡黄连苷Ⅱ可抑制神经细胞的凋亡，改善其神经组织超微结构，促进动物神经行为功能恢复。
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