2. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室, 北京 100850;
3. 山东步长神州制药有限公司, 山东 菏泽 274000
2. Dept of Pharmacology and Toxicology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China;
3. Shandong Buchang Shenzhou Pharmaceutical Co.Ltd. , Heze Shandong 274000, China
肿瘤血管为肿瘤生长提供足够的氧分和营养，靶向肿瘤血管生成可以达到抑制肿瘤生长的作用[1]。目前靶向VEGF的药物在临床上已经展现出很好的抗肿瘤作用，但该信号通路只能暂时地被抑制，一旦药物撤除，信号通路会重新激活，肿瘤组织迅速建立血供，生长速率有时会更快[2]。随着研究的深入，越来越多的证据显示，肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的异质性和可塑性导致其功能的多样性，可通过多种方式为肿瘤生长提供各种需求[3]，在肿瘤血管新生过程中也发挥着重要作用[4]。
研究发现[5]，肿瘤干细胞不仅可以通过产生大量的血管生成因子如VEGF、SDF-1/CXCR4和HIF，“引诱”血管延伸向自己靠拢，而且在许多因子的参与下，通过构建肿瘤细胞间通道，形成血管拟态，进而促进肿瘤血管的生成。此外，肿瘤干细胞还能够直接通过转分化成为血管内皮细胞，构成肿瘤新生血管的主要部分(Fig1A)，从而在肿瘤发生、发展过程中发挥重要角色[6]。例如，人们发现肿瘤内发生染色体变异的内皮细胞是由肿瘤干细胞分化而来；在血管较丰富的神经胶质瘤内部，70％的内皮细胞都是由肿瘤干细胞分化而产生的[7]。另有文献报道，位于血管周围微环境中胶质瘤干细胞，经历间质分化生成血管周细胞，支持血管的功能和肿瘤的生长[8]。为了研究肿瘤血管形成的来源及机制，我们体外低黏附、干细胞培养基诱导获得干细胞样U87胶质瘤细胞，并且在Matrigel上建立胶质瘤干细胞向内皮细胞转分化的体外模型[9]。
VEGFR2在CD133阳性的胶质瘤干细胞上高表达，影响着胶质瘤干细胞的活性、自我更新能力、致瘤性[10]，而且可能调控着胶质瘤干细胞向内皮细胞的转分化过程。因此我们以VEGFR2人源化单克隆抗体为例，利用建立的胶质瘤干细胞向血管内皮细胞转分化模型，研究药物对胶质瘤干细胞向血管内皮细胞转分化的干预作用。
1 材料与方法 1.1 实验材料Matrigel胶(BD公司)，RPMI 1640 培养基(Hyclone)，Accutase Solution(Millipore公司)，BD cell recovery solution(BD公司)，TRIzol(Sigma公司)，2×qPCR Mix(北京康为世纪生物有限公司)，FBS(Hyclone)，DMEM/F12(1 ∶ 1)培养基(Gibco公司)，表皮生长因子EGF、碱性成纤维生长因子bFGF(PeproTeth公司)，细胞因子B27 Supplement (Gibco公司)，CD133-PE流式抗体(美天旎公司)，抗VEGFR2人源化单克隆抗体(山东步长神州制药有限公司)，U87细胞(中国协和细胞库)，Hera cell-50 CO2气体培养箱，YT-CJ-1ND型超净工作台，超低黏附6 孔培养板、普通6孔细胞培养板(Corning公司)，AMG EVOS XL显微镜(AMG公司)，GUAVA流式细胞仪(Millipore 公司)，实时定量PCR仪(安捷伦Mx3005P)
1.2 实验方法 1.2.1 U87胶质瘤干细胞的获取普通U87胶质瘤细胞用10%FBS 的RPMI 1640 培养，传至三代后，消化收集细胞，接种在含DMEM/F12(1 ∶ 1) 无血清培养基的超低黏附6 孔培养板中，培养基中另外添加终浓度为20 μg·L-1 bFGF，20 μg·L-1 EGF，5 kU·L-1胰岛素，2% B27 等成分，置于37 ℃，5%CO2培养箱中。细胞呈悬浮状生长，并且相互聚集成干细胞球样，开始两周，每4~5天用Accutase Solution消化分散成单个细胞，传代，然后让其成球生长直至足够大小[11]。
1.2.2 U87胶质瘤干细胞的验证利用AMG EVOS XL显微镜照相，观察U87干细胞成球情况。然后将球样U87胶质瘤细胞用Accutase Solution消化分散成单个细胞，离心收集细胞，一部分细胞用于流式细胞仪检测胶质瘤干细胞标志物CD133的表达；另外一部分细胞用于提取RNA后定量PCR检测干细胞相关基因CD133、Nestin以及VEGFR2的表达情况，并且与普通培养的U87细胞作比较[12]。
1.2.3 U87胶质瘤干细胞成瘤实验Nu/ Nu鼠，雌性，体质量18~22 g，6~8周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司购买。实验动物许可证号：SCXK(京)2012-001。将超低黏附培养获得的干细胞球样U87胶质瘤细胞用Accutase Solution消化分散成单个细胞，普通条件下培养的U87细胞用胰酶消化，离心重悬、计数后，均按照细胞悬液浓度为每只2×106接种到每只Nu/Nu鼠右腋皮下，建立荷瘤鼠模型[13]，每组5只裸鼠。观察普通条件下U87细胞和低黏附培养获得的干细胞球样U87细胞肿瘤生长情况，4周后结束实验，将动物后颈部脱臼处死，剥离瘤块用于拍照、称重，然后储存在4%甲醛溶液中，以备HE染色和CD31免疫组化染色。
1.2.4 胶质瘤干细胞向血管内皮细胞转分化模型的建立将Matrigel基质胶放于4℃进行解冻，并且将6孔细胞培养板和200μl枪头放于冰上预冷，培养板每孔均匀铺入150 μl Matrigel，然后置于37℃培养箱中孵育30 min。将获得的U87胶质瘤干细胞用Accutase Solution消化成单个细胞后，离心计数，以3×107接种至铺有Matrigel的6孔板中，12小时后，照相观察微管状结构形成情况，并且利用BD cell recovery solution回收Matrigel上的细胞，提取RNA，经逆转录后，qPCR检测CD31、CD34、vWF等内皮细胞标志物基因的表达情况[11]。普通条件培养的U87细胞也按照上述方法进行实验，比较两种细胞的内皮细胞标志物基因CD31、CD34、vWF表达量的差别。
1.2.5 抗VEGFR2人源化单抗对U87干细胞向血管内皮细胞转分化的干预作用按照上面方法接种干细胞样U87细胞(3.5×107)至Matrigel建立转分化模型，然后将实验分为3组，包括空白对照组、抗VEGFR2人源化单抗50 mg·L-1组、抗VEGFR2人源化单抗200 mg·L-1组，每组重复3孔。处理后，37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，观察药物对微管状结构的影响，最后用BD cell recovery solution回收Matrigel上的细胞，qPCR检测CD31、CD34、vWF基因的表达变化。
1.2.6 RT-qPCR按照TRIzol法提取细胞总RNA，经反转录得到cDNA，取2×qPCR Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL和DNA模板1 μL，然后加DEPC水至20 μL。混匀后，置于qPCR仪中，95℃变性10 min，然后经95℃变性30 s，60℃退火30 s，共39个循环，扩增。最后统计实验结果，观察各基因的变化情况。实验中涉及的各基因引物：Actin上游引物5′-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′，下游引物5′-GAGGAGCAATGATCTTGATCTTCA-3′；CD133上游引物5′-AGGCACTTACGGCACTCTTC-3′，下游引物5′-TTTCTTCCTGCTGCACCCAA-3′；Nestin上游引物5′-CTGGAGCAGGAGAAACAGGG-3′，下游引物5′-CTGAGGGAAGTCTTGGAGCC-3′；VEGFR2上游引物5′-CCAGGCAACGTAAGTGTTCGAG-3′，下游引物5′-GGGACCCACGTCCTAAACAAAG-3′；CD31上游引物5′-CCAGTGTCCCCAGAAGCAAA-3′，下游引物5′-TGATAACCACTGCAATAAGTCCTTTC-3′；CD34上游引物5′-ACGGCCATTCAGCAAGACAAC-3′，下游引物5′-GCACGTGGTCAGATGCAGAGA-3′；vWF上游引物5′-AGCCCATTTGCTGAGCCTTG-3′，下游引物5′-CCTGGCACCATGCATTTCTG-3′。
1.2.7 数据统计用Origin 8.0软件进行数据的绘图，用Student′s t检验进行组间的统计学分析。
2 结果 2.1 U87干细胞球的形成将普通U87胶质瘤细胞消化收集细胞后，接种于超低黏附6 孔培养板中培养。 结果显示，细胞相互聚集成干细胞球样，且随着培养时间延长，干细胞球越来越大(Fig1B)。提示低黏附培养能够获得干细胞球样的U87细胞。
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| Fig 1 Trans-differnetiation of cancer stem cells and establishment of stem-like U87 A: Cancer stem cells trans-differentiate to endothelial cells; B: Establishment of stem-like U87 spheres |
用Accutase Solution将上述获得U87干细胞球样细胞消化分散成单个细胞，CD133流式抗体标记后，流式细胞仪检测发现干细胞样的U87细胞的干细胞标志物CD133表达量为31.82%，与普通培养的U87细胞相比，CD133表达量明显增加(Fig2)。
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| Fig 2 Morphology and CD133 expression of U87 cells, stem-like U87 spheres |
分别收集普通培养的U87细胞和低黏附、干细胞培养基诱导的U87干细胞球样细胞，用qPCR检测干细胞相关基因CD133、Nestin，并且检测两种细胞VEGFR2基因的差异，实验结果显示，干细胞样U87细胞CD133、Nestin和VEGFR2的表达均明显上调(P＜0.001)，差异有统计学意义(Fig3)，以上结果提示我们获得了干细胞样的U87细胞。
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| Fig 3 The CD133, Nestin, VEGFR2 expression of U87 cells, stem-like U87 spheres using real-time PCR **P＜0.01 vs U87 cells |
将获得的干细胞球样U87细胞和普通的U87细胞均以每只2×106细胞的浓度接种到每只Nu/Nu鼠右腋皮下，建立荷瘤鼠模 型，结果发现干细胞样U87细胞和普通培养的U87细胞均能在小鼠皮下成瘤，但是干细胞样U87细胞长出的肿瘤生长比普通培养的U87细胞的移植瘤更快(P＜0.05)(Fig4A)。d 31干细胞样U87细胞移植瘤的体积为(1 734.60±605.50) mm3，而普通培养的U87细胞移植瘤的瘤体积只有(875.28±472.67) mm3。将动物脱臼处死后取出瘤块并称重，发现干细胞样U87细胞移植瘤的瘤重也明显增加(P＜0.05)，其为(1.68±0.74) g，普通培养的U87细胞移植瘤的瘤重则为(0.60±0.38) g(Fig4B，Fig4C)。
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| Fig 4 Tumorigenic assay of U87 cells, stem-like U87 spheres A: The tumor volume of U87 cells, stem-like U87 spheres; B: The tumor weight of U87 cells, stem-like U87 spheres; C: The tumors of U87 cells, stem-like U87 spheres. **P＜0.01 vs U87 cells |
对两组肿瘤进行HE染色和CD31免疫组化分析，结果显示普通培养的U87细胞和干细胞样U87细胞均能成瘤，且都有CD31标记的血管存在。但是干细胞样U87细胞的肿瘤中CD31表达明显要多于普通培养U87细胞肿瘤(Fig5)。
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| Fig 5 HE staining and CD31 immunostaining of U87 cells,stem-like U87 spheres xenografts A: HE staining of U87 cells, stem-like U87 spheres xenografts; B and C: CD31 immunostaining of U87 cells, stem-like U87 spheres xenografts |
干细胞样U87细胞(3×1010 cells·L-1)接种至铺有Matrigel的6孔板中，12 h后，用AMG EVOS XL显微镜观察微管状结构形成情况。Fig6显示干细胞样U87细胞在Matrigel上确实能够形成血管状结构。利用BD cell recovery solution回收Matrigel上 的细胞，qPCR检测CD31、CD34、vWF等内皮细胞标志物基因的表达情况，结果显示接种在Matrigel上的干细胞样U87细胞内皮细胞标志基因CD31、CD34、vWF均表达量增加(P＜0.001)，提示可能干细胞样U87细胞发生转分化，形成了内皮细胞(Fig7B)。
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| Fig 6 Stem-like U87 cells developed morphological feature of endothelial cells on Matrigel |
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| Fig 7 Effect of anti-VEGFR2 human monoclonal antibody on trans-differentiation A: Anti-VEGFR2 human monoclonal antibody inhibited the formation of capillary-like structures,A1:Control;A2:50 mg·L-1;A3:200 mg·L-1; B: Anti-VEGFR2 human monoclonal antibody decreased expression of CD31, CD34 and vWF.*P＜0.05, **P＜0.01 vs Control |
建立U87胶质瘤干细胞 向内皮细胞转分化模型后，加入抗VEGFR2人源化单抗50、200 mg·L-1，12 h后qPCR检测CD31、CD34、vWF表达量，发现与接种在Matrigel上且不加药的细胞相比，抗VEGFR2人源化单抗50、200 mg·L-1给药组的微管状结构明显减少(Fig7A)，而且CD31、CD34、vWF基因的表达都有所降低(P＜0.05,Fig7B)。这些结果说明抗VEGFR2人源化单抗能够抑制胶质瘤U87干细胞向血管内皮细胞转分化。
3 讨论上世纪70年代Fulkman[14]提出抑制肿瘤血管形成能够“饿死”肿瘤的理论。随后的研究证明，肿瘤的发生、发展及侵袭转移都离不开肿瘤血管的形成，干预肿瘤血管形成的环节或条件均可抑制肿瘤的生长，例如Bevacizumab(VEGF拮抗剂)在美国获批的适应症有结直肠癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、复发性成胶质细胞瘤等。2014年4月，FDA批准抗VEGFR2单抗ramucirumab上市，主要用于化疗失败的胃癌、胃食管连接处腺癌。apatinib(VEGFR2选择性抑制剂)即将被CFDA批准作为晚期胃癌的治疗药物。虽然这些靶向肿瘤血管的药物在临床上已经展现出较好的治疗作用，但仍然会出现肿瘤耐药、复发和转移，以及药物不良反应等情况[2, 15]，具体原因可能与复杂的肿瘤血管调控机制有关。近年来，研究者们发现肿瘤干细胞与肿瘤血管新生有密切的联系，尤其是肿瘤干细胞能够通过转分化方式形成血管内皮细胞，直接参与肿瘤血管的形成[16]。因此在研发抗血管生成药物时，应该重视肿瘤干细胞在血管生成中的作用，通过选择性靶向肿瘤干细胞和肿瘤血管的关联性，从而达成治疗目的。
因此，有必要建立一种简单可靠的干细胞向内皮细胞转分化的模型。我们通过体外诱导获得干细胞样的U87细胞，然后接种在Matrigel上建立胶质瘤干细胞向内皮细胞转分化模型。实验结果发现干细胞样U87细胞在Matrigel上确实能形成血管状结构，内皮标志物基因CD31、CD34、vWF表达量也均上调，提示干细胞样U87细胞在该实验条件下可以转分化形成内皮细胞。干细胞样U87细胞成瘤性实验结果表明，干细胞样U87细胞在Nu/Nu鼠皮下能够形成肿瘤块，并且比普通的U87肿瘤生长的迅速；病理和免疫组化结果提示，干细胞样U87细胞形成的肿瘤组织中血管比普通U87的肿瘤中血管要丰富和密集。这一结果也能提示干细胞样U87细胞能够通过转分化形成血管内皮细胞，进而形成血管。
VEGFR2是转导VEGF血管新生信号的关键受体，对血管内皮细胞增殖、肿瘤的生长和转移都起着重要作用。VEGFR2在正常人体组织中呈低水平表达，而在血管内皮细胞和CD133阳性的胶质瘤干细胞中呈高表达[17]，并且影响着胶质瘤干细胞向内皮细胞的转分化过程[18, 19]。因此，选择性靶向VEGFR2或许可以产生很好的治疗前景。我们以抗VEGFR2人源化单克隆抗体为受试药物，发现抗VEGFR2人源化单抗能够明显抑制干细胞样U87细胞在Matrigel上形成血管状结构，并且下调内皮细胞相关基因CD31、CD34、vWF的表达。
综上所述，我们通过体外诱导获得干细胞样 U87胶质瘤干细胞，该细胞能够在Matrigel上形成血管状结构、转化成内皮细胞，且抗VEGFR2单克隆抗体能够抑制胶质瘤干细胞向内皮细胞转分化。
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