类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA) 是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的自身免疫性疾病，它的基本病理改变为关节滑膜慢性炎症，进而造成关节软骨和骨质的破坏，最终导致关节畸形[1]。近些年从细胞和分子水平研究RA的机制已经获得巨大进步，但是目前仍未找到有效治疗RA的药物。早在1980年,Krishtal等[2]就已经在神经元上记录到氢离子激活的阳离子电流，但其研究进展缓慢，直到1997年由Waldmann等[3]克隆了第1个酸敏感离子通道(ASICs)亚基后，对ASICs的研究在近几年成为研究的热点之一，其在组织缺血、缺氧、酸化、炎症、疼痛、伤害感觉等过程中都起着重要作用，而这也为RA的机制研究提供一个新的方向，并为RA临床治疗提供方向和思路。
1 ASICs 的细胞生物学特点 1.1 ASICs的基本构型ASICs又称H+非电压门控阳离子通道，属于阿米洛利敏感的上皮钠通道/退变素(epithelial Na+channels/degenerin,ENaC/DEG)超家族中的一员。到目前为止，已克隆出来由4个基因编码的7个ASIC亚 基：ASIC1a(ASIC/ASICα/BNaC2α)、ASIC1b(ASICβ)、ASIC1b2(BNaC2β)、ASIC2a(MDEG1/BNaC1α/BNC1a)、ASIC2b(MDEG2/BNaC1β)、ASIC3(DRASIC/TNaC)、ASIC4(SPASIC) [4]。每个ASIC亚基大约包含500多个氨基酸，已发现每个ASIC亚基包含两个跨膜区域(TM1和TM2)、1个大的胞外环和胞内C末端和N末端(Fig1)[5]。晶体结构分析发现ASICs是以三聚体形式存在的[6] 。这些亚基所组成的同聚体或异聚体是质子门控的阳离子通道，具有不同特性，但ASIC2b或ASIC4组成的同聚体目前还没有发现其功能活性。
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| Fig 1 Topological structure of ASICs |
ASICs在中枢和外周感觉神经元以及非神经组织中有着广泛的分布，但不同的亚基在组织中的分布具有特异性，中枢神经系统主要表达ASIC1a、ASIC2a、ASIC2b；而在外周神经系统表达所有亚基[7]。ASIC1a主要分布在大脑皮质、海马、小脑、松果体缰、杏仁核、背根神经节、骨等处；而ASIC1b只在感觉神经元上表达；ASIC2a表达于耳蜗和视网膜结构中，在味蕾细胞、软骨中也有分布；ASIC3分布在背根神经节(DRG)，尤其在一些伤害性感觉神经元中，越来越多研究显示ASIC3在非神经组织中表达较为广泛；ASIC4在内耳神经元以及腺垂体前叶中有表达[8]。
1.3 ASICs的电生理特性虽然ASICs的结构很相似，但其电生理和功能也有所不同，ASIC1a是目前发现唯一对Ca2+有通透的亚基[9]，而所有ASICs的亚基均为Na+通透性通道。ASICs的不同亚基对酸敏感的程度也有所不同，ASIC1a对细胞外H+敏感性最高，pH0.5为6.0，但失活较迅速；而ASIC2a对H+的敏感性则较低，pH0.5为4.7，但失活较缓慢，胞外pH值的下降可以使ASIC2a的同聚体通道迅速脱敏；ASIC2b的同聚体是没有活性的，但其异聚体通道是有活性的[10, 11] ，在ASIC2b形成的异聚体中，ASIC2b的功能是改变通道的选择性，并可以在瞬时电流峰值后诱发一个非选择性的阳离子电流，来对异聚体通道的电流进行调控[10]；在高强度的疼痛刺激以及酸诱导的痛觉过敏中，ASIC3发挥了重要作用，同时也参与大的感觉神经元对机械刺激的感应；ASIC3同聚体所介导的电流包含两个部分：瞬时部分和稳态部分，但这两个部分对细胞外氢离子的敏感性有很大的差异[12]。目前对于ASIC4了解较少，对于其电生理学特性有待进一步研究。
2 ASCIs在RA病变组织中的表达及病理生理过程中的作用 2.1 ASICs在RA病变组织中的表达组织酸化是缺血、缺氧、炎症时的一个共同特征，大量研究均表明机体可以通过ASICs来感受pH值的下降，进而调控相应组织发生改变。研究表明，RA中存在关节局部组织的酸化，那么关节炎症部位是否也通过ASICs感受胞外pH值降低呢？
Holger等[13]发现在人成骨细胞中有ASIC1、ASIC2 和 ASIC3的表达，并用Western blot和免疫组化染色证实了蛋白表达，而ASIC4表达量很少。这一发现为酸诱导骨病提供一个研究方向，但是在动物骨骼上，尤其在骨超微结构水平上还没有投入关注，不久，本课题组研究证实大鼠关节软骨存在ASIC1a、ASIC2a和ASIC3 mRNA及其蛋白的表达[14]；进一步又在弗氏完全佐剂(CFA)诱导佐剂性关节炎(AA)大鼠模型中检测到ASIC1a、ASIC2a和ASIC3 mRNA及其蛋白表达的上调，从而得出ASICs的表达增多，可能与关节软骨破坏有关的结论[15]。Voilley等[16]在大鼠右足注射50 μL CFA诱导佐剂性关节炎的模型中，发现DRG神经元即伤害感受器中主要表达的ASICs都增加了1~2倍，其中ASIC3表达明显增加，提示ASIC3参与了关节炎疼痛的形成；之后又陆续在滑膜细胞[17]、炎症细胞[18]上发现了ASICs的表达，并且参与了RA的病理生理过程。
2.2 ASICs对滑膜细胞分泌的影响RA的发病机制目前仍不清楚，成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)及其分泌物在RA的发生和发展中具有关键的作用。Kolker等[17]在ASIC3+/+小鼠和ASIC3-/-小鼠中通过组织化学等方法来比较关节的形态、透明质酸以及ASIC3的表达，并用分离的FLS来研究透明质酸的分泌和细胞内钙离子对pH值降低的反应，结果显示在ASIC3+/+小鼠的关节软骨、半月板和B型滑膜细胞中都有ASIC3的表达，在pH=5.5时，ASIC3-/-小鼠的 FLS中胞内Ca2+明显少于ASIC3+/+小鼠，提示ASIC3可能作为细胞内pH传感器，并且对关节组织中透明质酸的表达具有调控作用。到目前为止，在滑膜中只有对ASIC3的研究报道，尚未发现其它亚基的报道，而ASIC1a对于Ca2+具有通透性，其是否表达并参与滑膜细胞内Ca2+增加，进而影响滑膜细胞增殖和炎症因子的释放，有待进一步研究。
2.3 ASICs对炎症细胞成熟与分泌的影响近年来，大量的研究证实，RA 是免疫功能紊乱所致的炎症反应性疾病，不仅有细胞免疫紊乱，体液免疫紊乱亦参与作用。RA关节组织中浸润的单核/巨噬细胞、淋巴细胞等产生的炎症因子(如IL-1、IL-6、TNF-α等)在RA病变中起核心作用。Tong等[18]发现ASIC1、ASIC2、ASIC3在树突状细胞中表达，胞外酸化时可通过AISCs促进细胞成熟和抗原呈递能力，提示AISCs参与了酸调控树突状细胞的功能。Jancic等[19]发现胞外的酸化可以增加人单核细胞分泌IL-1β，部分是通过上调pro-IL-1β的基因表达来实现的，但没有促进TNF-α与IL-6的增加，推测ASICs可能也参与其中。Kong等[20]研究发现，胞外的酸化可以促进巨噬细胞的成熟和吞噬功能以及IL-10的分泌，同时发现巨噬细胞上有ASIC1和ASIC3的表达，而这种促进作用可以被阿米洛利和非甾体抗炎药阻断，提示ASICs可能作为一种新靶点治疗免疫性疾病。
2.4 ASICs参与关节炎疼痛的形成众所周知，慢性关节炎疼痛是RA最突出的临床特征之一，而这种疼痛是隐匿的、持续的。近来大量文献报道，质子 ( H+) 在组织中的积累，可以直接导致痛觉产生和痛觉过敏，ASIC3作为主要的酸感受器，在酸化所致的伤害和疼痛感受中起着重要的作用[21]。Babinski等[22]发现在胶原性关节炎模型的疼痛中ASIC3被激活，而在佐剂性关节炎中也得到了验证[21]。
Ikeuchi等[21]研究发现炎症导致的pH下降会激活膝关节部位初级传入神经元中的ASIC3，进而增加疼痛传入，导致中枢疼痛过敏，同时发现ASIC3对次级疼痛过敏起着重要作用，而对初级疼痛过敏影响较弱，而在角菜胶诱导关节炎中也发现了ASIC3表达上调[23]。Yen等[24]进一步研究表明，在CFA或角菜胶诱导的急性炎症模型(4 h)中，与ASIC3+/+相比，ASIC3-/-鼠具有正常的热和机械痛觉过敏，但在亚急性期(1~2 d)除了CFA诱导的模型外，其他模型的热和机械痛觉过敏都有所增加。Deval等[25]研究发现ASIC3特异性阻断剂APETx2和siRNA沉默ASIC3都可以对炎症导致的痛觉过敏起到下调作用。Izumi等[26]也验证了APETx2对痛觉过敏以及负重疼痛的抑制作用。
因此，ASIC3 在痛觉致敏过程中发挥重要的作用，可能是炎症因子促进ASIC3 表达增加，同时pH值下降又会激活ASIC3通道，Na+内流提高神经元兴奋性，最终引发炎性痛觉过敏；然而进一步研究需要来确认炎症因子上调ASIC3酸敏感性和表达的具体机制。
2.5 ASICs对软骨损伤的影响在RA的发病过程中，关节软骨破坏是致残的根本原因，因此寻找关节软骨和骨组织破坏的关键环节显得尤为重要。凋亡和自噬是细胞在炎症、缺氧、激光辐射等外界刺激下的主要应激反应形式，已经证实，骨关节炎中关节软骨细胞的死亡是一种凋亡与自噬的结合。最近研究表明，RA的患者关节软骨细胞上存在过度凋亡和自噬的过度激活并在关节软骨破坏中发挥重要作用[27]。
为了探明ASICs在软骨损伤中的作用，本课题组在含有Ca2+的培养基内培养软骨细胞，当细胞外pH=6.0时，细胞内Ca2+增加，使用ASIC1a特异性的阻滞剂PcTX能够明显降低细胞内Ca2+增加并抑制酸诱导的关节软骨损伤，提示胞内Ca2+增加可能是ASIC1a介导的，这对于酸诱导的关节炎具有重要的作用[28]。进一步研究表明，在封闭ASICs时明显降低细胞死亡率和增加细胞活力；用阿米洛利预处理细胞，可抑制酸诱导软骨细胞内Ca2+上升和钙蛋白酶、钙依赖磷酸酶的表达水平以及caspase-3的活性[29]。体外研究发现阿米洛利以剂量依赖性方式抑制软骨细胞的凋亡，此外，在酸诱导的软骨细胞中，阿米洛利能够部分地恢复线粒体膜电位水平，可能是通过调控细胞凋亡相关基因Bcl-2家族mRNA的表达、caspase-3/9的活性以及保护线粒体功能来实现的[30]。
最近，研究显示[31]pH 5.5和pH 6.0胞外酸化刺激均能明显升高软骨细胞自噬水平；而ASIC1a的阻断剂PcTX1可以明显的抑制软骨细胞自噬基因Beclin-1、自噬蛋白LC3、ERK1/2、p38MAPK磷酸化蛋白表达水平以及自噬小体数量。结果提示胞外酸化环境下能诱发软骨细胞自噬，阻断 ASIC1a 能明显减弱酸化诱导的软骨细胞自噬，其机制可能与抑制 ERK1/2 磷酸化有关。以上这些发现提示在RA关节软骨破坏中，ASICs可能是通过调控细胞凋亡与自噬来发挥作用。
3 ASICs在治疗RA中的应用
目前治疗RA药物主要有非甾体抗炎药、改变病情抗风湿药等，虽然对于RA的治疗药物不断被开发，但临床上尚缺乏根治及预防的有效措施。
近些年来，随着ASICs的研究不断的深入，越来越多的ASICs抑制剂已被发现和研制出[4]，以ASICs 作为靶点将开启治疗RA研究的新领域。Voilley等[16]发现非甾体抗炎药可以阻断ASICs，为了进一步探究ASICs的抑制剂在RA中作用，本课题组通过[32]分析常用药物对AA大鼠关节软骨细胞中ASICs表达以及蛋白聚糖体表达的影响，结果显示阿司匹林对AA大鼠关节软骨中的ASICs表达有明显抑制作用，可增加AA大鼠关节软骨基质中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖体的表达量，提示阿司匹林通过抑制ASICs的表达而抑制AA大鼠软骨细胞的破坏。后续研究发现在AA大鼠关节软骨中阿米洛利能够降低胞内Ca2+浓度和Mankin评分，而且可以阻止酸诱导的关节软骨细胞的损伤，同时降低蛋白聚糖体以及Ⅱ型胶原蛋白的mRNA和蛋白表达量[33]。Kuduk等[34]发现将ASIC3的非选择性阻断剂阿米洛利局部注入大鼠同侧后足爪，可明显减轻由5-HT和辣椒辣素诱导的伤害性行为，而用ASIC3特异性阻断剂APETx2注入大鼠关节皮下，对关节炎疼痛有明显抑制作用。Karczewski等[35]将APETx2肌注于AA大鼠中，再一次证明了阻断ASIC3可以抑制关节炎疼痛。
众多数据表明，通过抑制ASICs可为治疗RA提供一种新的思路，但目前在抑制剂研究中发现以阿米洛利为代表的药物，对ASICs无选择性；而以PcTX1为代表的动物毒素，虽有选择性，但其毒性大，因此寻找合适的ASICs抑制剂将决定干预ASICs疗法能否在临床中应用。
4 展望酸碱平衡是维持正常生理活动的重要条件之一，几乎各种疾病，如缺血、炎症、缺氧、癌症等的过程都会引起不同程度的pH值变化，而ASICs作为酸重要的感受器，其影响着组织病理生理的改变。持续的研究发现ASICs表达于滑膜、软骨等组织中并且介导了酸调控滑膜细胞、软骨细胞、炎症细胞的功能和代谢以及关节炎疼痛的形成，进一步确定ASICs与炎症细胞因子之间的关系以及ASICs各亚基参与RA具体机制将有助于探明RA的发病机制和病理过程。目前ASICs在RA中的研究尚处于起步阶段，然而随着研究的不断深入，ASICs将有望成为RA治疗的新靶标。
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