2. 江西财经大学职业技术学院, 江西 南昌 330013
2. Vocational Technical College, Jiangxi University of Finance and Economics, Nanchang 330013, China
维持神经元长程的有效信息交流非常重要。神经元的远距离信号转导是通过称为信号转导内体(signalling endosome)的众多核内体以微管依赖性方式转运[1]。信号转导内体是靶细胞分泌的信号分子可激活轴突末梢相应受体形成配体-受体复合物，在细胞内吞作用下进入内体形成的胞内吞细胞器，可从轴突逆行转运至胞体的这种细胞器具有信号转运功能[1]。近年来，信号转导内体运输已成为一个重要的研究热点，内体运输受损影响神经元的生存[2]，了解其研究方法有助于加深对这一热点研究的认识。
1 信号转导内体的概念及其在轴突运输中的作用神经元之间信息交换是通过长程的轴突运输完成。神经营养因子(neurotrophin,NT )作为信号分子是通过长程运输从外周到胞体对神经元的生存产生重要作用。NT家族包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子 4/5 (NT4/5) 和神经营养因子3(NT3)[3]。核内体(endosome，又称内体)是一种真核细胞中的膜结合细胞器，属于一种囊泡结构。轴突运输中信号分子通过激活相关受体形成配体-受体复合物，在细胞内吞作用下进入内体，形成神经元轴突中的胞内吞细胞器。胞内吞细胞器从轴突运输至胞体，具有信号转导功能的这种胞内吞细胞器称为信号转导内体[4, 5]。信号转导内体对细胞信号进行调节与分类，参与轴浆的逆行运输。信号转导内体不仅为逆行传输信号的重要来源，同时使细胞内信号高度编组和区隔化，从而确保信号转导(尤其是长距离信号转导)的特异性和持久性[6]。神经元轴突末端信号可由信号转导内体依赖微管转运至胞体，并有多种受体-配体复合物参与，这种受体-配体复合物如作为“货物”的配体-NT或受体-神经营养因子受体(NTR)及其复合物(NT-NTR)。阿尔茨海默病的发病原因之一为神经元的微管马达蛋白出现异常改变，导致轴突运输障碍，使重要物质无法运输到轴突末梢，影响轴突末梢与胞体的信息交流，使突触功能失调，导致神经元死亡，细胞间通讯中断，最终引起认知功能发生障碍[7]。因此，轴浆运输的中断或缺失与神经退行性疾病密切相关。
根据细胞内吞作用的不同时间阶段，内体分为初级内体、次级内体以及再循环内体，并可被如GTP结合蛋白Rabs等蛋白标记物而区分。神经营养因子信号是神经元生长的关键因素。神经营养因子的内吞作用是神经营养因子信号的基本特征[8]。神经营养因子通过轴突逆向运输至胞体，对突触的生长和神经元的存活起着重要作用。神经营养因子及其受体通过信号内体转运逆行信号。在信号转导内体的形成过程中，靶组织释放的NT结合到轴突末端Trk受体，配体受体复合物通过内吞途径进行内化。内吞形成的隔室分开运输神经营养因子信号分子，由不同的内吞途径可能形成早期内体、多泡体、晚期内体及巨大内体等形式，并通过微管将NT信号逆行转运到胞体[1]。
2 标记和追踪研究方法 2.1 神经营养因子标记法NT标记法广泛应用于研究神经营养因子及其受体的逆向轴突运输。早期的研究中，有学者将放射性核素125I标记的神经生长因子注入啮齿动物的虹膜和唾液腺里，用以追踪被标记的神经生长因子在细胞体的累积[9]。也有研究通过向小鸡胚胎的眼肌中注射其他的放射性同位素示踪的神经营养因子(125I-BDNF、125I-NT3 和125I-NT4/5)，观察放射性同位素示踪的NT在动眼神经元的逆向轴突运输。放射性同位素标记法的优点在于其较容易量化。然而，此方法需要相对较高的蛋白量(皮克)来实现可靠的检测。此外，放射性同位素标记神经营养因子的研究方法时空分辨率差。如将同位素示踪法与下述几种方法相结合检测可能会达到更好的效果。
2.2 荧光标记神经营养因子及其受体神经营养因子嵌合荧光、荧光标记抗NTR抗体、用荧光染料直接标记神经营养因子和/或其受体可以直观地观察它们的运输状况。例如，将绿色免疫荧光蛋白(GFP)融合到神经营养因子受体细胞内结构域的方法常广泛用于研究信号转导内体的轴突运输[10]。此外，绿色荧光蛋白标记的脑源性神经营养因子也可用于研究信号转导内体轴突运输的分泌及吸收。背根神经节神经元(DRG)的研究显示，用绿色免疫荧光蛋白标记酪氨酸激酶的Trk B 受体(TrkB-GFP)可表达在信号转导内体中，并参与轴突的逆向运输[11]。神经营养因子及其受体嵌合荧光法也是研究神经营养因子及其受体成像的重要工具。Tani 等的研究表明，神经营养因子与化学荧光的直接结合可用于小鸡 DRG生长锥上神经营养因子膜动力学的可视研究。然而，这种方法需要嵌合蛋白的过表达，而过表达可能改变生理信号转导。
2.3 量子点量子点(quantum dots,QDs)又称为半导体纳米晶体 (semiconductor nanocrystal)，它是能克服有机染料和同位素的一些缺陷的新标记物。QDs是由1种Ⅱ-Ⅵ族 (如 CdSe、CdTe、CdS 等)或 Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒，当前研究较多的是 CdSe、CdTe 等。对量子点而言，其最大的优点是耐光漂白。有机荧光团在光激发下可发生不可逆的光致化学反应，最终导致其失去荧光。由于其非有机的自然特性，QDs受光漂白的影响要小很多。耐光漂白对需要长时间观察和成像的实验来说非常重要，比如利用荧光标记观察细胞的传输过程或跟踪单个膜结合分子的运动路径等。QDs相对于其他化学或基于绿色免疫荧光蛋白的荧光素来说更具有光稳定性。QDs因为其特性已经被用于神经营养因子及其受体运输的研究，例如，酪氨酸激酶TrKA 的内吞作用，往返运输和重新分配[12, 13]。然而，国内外有报道，当细胞吞噬量超过其容载浓度后，就会出现QDs的毒性，影响细胞生长。生物标记中最常用的 CdSe/ZnS QDs的毒性主要来自从 CdSe 晶格中释放出来的游离 Cd2+，当其暴露于空气中会使QDs表面氧化，最终导致 Cd2+ 的释放[14]。有研究表明QDs通过胞内吞作用而被细胞吸收，当它接触到内体结构中低pH的环境时，QDs部分降解并释放镉离子，从而降低它的荧光强度并增强颗粒毒性[15]。
2.4 病毒和毒素许多种病原体和位于神经元质膜上的受体相互作用，并且一旦内化则可进行长程的轴突运输。早期的研究表明，病毒和细菌毒素是较好地理解神经元运输途径的分子工具[16]。在细菌毒素中，荧光结合的肉毒素(BoNTs)和破伤风毒素(TeNT)片段已被证实是研究轴突运输的工具。在运动和感觉神经元中，TeNT在外周被内化并逆向运输至神经元的胞体；TeNT的一个无毒片段保持着整个毒素的内化作用和长程运输的特性，它可与神经营养因子及其受体共同在轴突进行逆向运输[17]。
狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒和犬腺病毒 2(CAV2)也可用于神经元长距离运输的研究[18, 19, 20]。特别是CAV2曾被证实在运动神经元中和NT及其受体在同一区室内进行逆向运输[19]。
3 用于研究轴突运输的装置与技术 3.1 Campenot 室体外大量培养的神经细胞不能体现其生存在体内微环境的情况。现已发明若干种将胞体从神经元网络分隔的装置，其中最成功地装置是Campenot室(Campenot chambers)。在早期的结构中，Campenot室包括三个隔室，是由高分子聚四乙烯在组织培养皿顶部构建的分隔密封装置。神经元放置在中间隔室，同时在外隔室辅以不同的生长因子。聚四乙烯隔物与培养皿表面通过硅密封来达到区室的相互隔离，但是有足够的空间使神经突起穿过隔离处并延伸至外隔室。这些装置起初用于说明神经生长因子在神经轴突延伸时的局部效应。利用它们可对神经营养因子的时空影响因素进行严格控制的优点，后来也成功地应用于内体信号的传输和研究中。然而，Campenot室虽然易于处理不同的操作者引起的变量改变和机械损伤所带来的影响，但是其在活细胞成像中存在一定的问题[21] 。
3.2 微流体系统微流体系统由一块聚二甲硅氧烷构建，上面有一些小隔间，隔间之间通过细微纹沟连接。整个装置放在一个玻璃的盖玻片上，盖玻片提前要用多聚赖氨酸包被以便神经细胞的贴壁。神经细胞种植在一个间隔中，轴突通过微细纹沟延伸到另一隔室中。微流体系统与Campenot室类似，旨在实现轴突与细胞体的隔离。然而，和Campenot室不同的是,微流体系统的分隔不是机械化的，而是流体凭借细微纹沟置于两个隔室之间。
微流体室具有透明和防水的特点。这些特征使得微流体系统成为活细胞成像的一种有效研究工具。细微纹沟的长度与厚度可以调整成适应不同神经元群的生长速率的形式。这些特征使得微流体室成为研究轴突运输中神经营养因子及其信号转导作用的非常有价值的研究工具[4]。双室的微流体装置用于皮层神经元轴突再生的研究，指导轴突或胞体的治疗[21]，并可同非神经细胞共培养[22]。有研究将脊髓运动神经元与神经肌肉于微流体室中共同培养，研究脊髓下运动神经元与神经肌肉之间的通讯[23]。
目前,已发明一种应用液态氟碳油栏隔离不同区室细胞的微流体细胞共培养装置，用液态油栏隔离的微流体装置研究海马神经元单独转染绿色荧光蛋白标记和mCherry荧光蛋白标记的cDNA。结果表明在GFP标记的细胞培养室中，没有出现神经元转染mCherry荧光蛋白的现象，说明液态油栏可以很好地隔离微流体装置的不同区室[24]。利用微流体共培养系统培养神经元和神经胶质细胞可能有助于维持神经元在类似整体的生理状态，进而提高神经元的转染效率[25]。相比Campenot培养系统，微流体系统具有更易操作、重复性好，可获取介质中不同梯度的信号分子，特别是可隔离神经网络的不同部分，如不同类型神经元或靶细胞。因此，微流体系统具有同时维持不同细胞群体在物理和流体上隔离的特点。
3.3 坐骨神经结扎因为坐骨神经是最长并最容易获得的轴突，从而使坐骨神经结扎方法成功地运用于在体轴突运输的研究中。啮齿动物经麻醉后，用医用镊子将丝线从坐骨神经下方穿过并轻微结扎，这一过程可抑制轴突运输，但没有损伤神经轴突和神经近端之间的邻近组织。研究发现神经营养因子及其受体和信号分子可积聚在坐骨神经结扎的远侧端。这项技术的另一个应用是分离活体动物的坐骨神经末端到特定的缓冲液集合器中，完整的囊泡运输可在不被周围细胞干扰的情况下收集。坐骨神经结扎实验与放射性同位素标记的神经营养因子的方法相结合可用于研究囊泡运输的运输速率和运输囊泡的数量。除坐骨神经结扎外，位于小鼠脊髓、坐骨神经和肋间神经的单个轴突的活体成像，都可用于检测轴突中细胞器的动力学变化[26, 27]。
4 结语与展望放射性同位素标记法容易量化，但检测的可靠性需要较高的蛋白量来保证，但其时空分辨率较差，此时可将放射性同位素示踪法与荧光标记、量子点方法相结合才能达到更好的效果；荧光标记神经营养因子及其受体的方法已广泛用于轴突运输中信号转导内体的研究，但是这种方法需要嵌合蛋白的过表达，可能会改变生理信号转导；量子点是能克服有机染料和同位素一些缺陷的新标记物，有特异的光学特性，可是当细胞吞噬量超过其容载浓度后，会使量子点的毒性表现出来，从而影响细胞生长。
Campenot室易于处理不同的操作者引起的变量改变和机械损伤所带来的影响，但是它们在活细胞成像中存在一定的问题，是需要在今后研究中加以克服。与Campenot培养系统相比，微流体系统更易操作、重复性好，可用于不同类型的神经元或靶细胞之间的研究，具有同时维持不同细胞群体的物理和流体上隔离的特点。
轴突运输中信号转导内体的不同研究方法各有其优点与缺点。在未来的研究中，将神经营养因子的同位素标记法与荧光标记法、轴突运输方法相结合进行研究，相互之间取长补短，进一步完善，为各种实验需要提供有效的研究方法，从而促进神经元的远距离信号转导研究。
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