多药耐药相关蛋白2(MRP2/ABCC2)属于ABC转运蛋白超家族,肝脏细胞所表达的MRP2,能介导一些有机阴离子的转运,例如葡萄糖醛酸盐结合物等物质的转运[1]。胆汁酸盐输出泵转运蛋白(BSEP)是肝脏中参与胆汁外排转运的另一重要的转运体,主要介导单价胆汁酸、硫酸盐胆酸等转运过程。在肝细胞中MRP2和BSEP相互协调,可以介导胆汁的排泄,这两种转运体的表达均可以在转录和转录后两个水平上受到调节[2, 3]。有文献报道,核转录因子Nrf2可以影响MRP2底物的分泌和排泄,Nrf2能够在异物的刺激下与MRP2基因增强子近端的 ARE元件结合而调控其表达[4]。
黄芩素(baicalein,BAI)是黄芩干燥根中提取的有效成分,具有多种药理作用[5, 6, 7, 8, 9]。临床上,中药黄芩常与多种中药配伍用于治疗胆汁淤积等肝脏疾病,有很好的利胆及助黄疸消退的作用。目前,BAI对肝脏胆汁外排转运体MRP2和BSEP的表达影响尚无明确报道,因此,本研究旨在研究BAI对MRP2和BSEP表达的作用,同时探讨BAI对核转录因子Nrf2核转位的影响。
1 材料与方法 1.1 材料人肝癌HepG2细胞株,购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基和胰酶购自美国Hyclone公司,胎牛血清购自美国Gibco公司;萝卜硫素(1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷,Sulforaphane,SFN)购自美国Sigma公司,BAI购自上海丽臣生物科技有限公司;MRP2抗体和β-actin抗体购自美国Abcam公司,BSEP抗体、Nrf2抗体和GAPDH抗体均购自美国CST公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将HepG2细胞接种于含10%胎牛血清、双抗(1×105 U·L-1青霉素及100 mg·L-1链霉素)的DMEM培养基,5% CO2、37 ℃常规培养。阳性对照药物SFN及黄芩素均溶解于DMSO溶液中。
1.2.2 Real-time PCR将给予药物处理24 h的细胞用PBS清洗两遍之后提取总RNA,并用TaKaRa逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA之后进行荧光实时定量PCR检测。采用相对Ct值(△Ct)的方法对目的基因的表达水平进行定量。
1.2.3 Western blot将药物处理后的HepG2细胞提取蛋白与核蛋白并采用BCA试剂盒定量,置-80℃保存。每次上样前99℃变性10 min,以加入8%SDS-PAGE胶(碧云天试剂盒)中进行电泳。将凝胶上的蛋白用230mA进行恒流电转,GAPDH和Nrf2电转时间为90 min,PVDF膜;MRP2和BSEP电转时间为150 min,NC膜,封闭60~120 min。封闭后的电转膜进入按比例稀释好的一抗(GAPDH为1 ∶ 1 000,MRP2为1 ∶ 75,BSEP为1 ∶ 500,Nrf2为1 ∶ 200),4℃过夜孵育洗膜,置于二抗中室温孵育60~90 min(兔抗和小鼠二抗按1 ∶ 1 000稀释)。最后对电转膜进行曝光成像,分析。
1.2.4 统计学分析采用SPSS软件对所得数据进行统计学分析,各组数据均采用 ± s表示。在P<0.05水平使用 ANOVA分析进行组间比较。
2 结果 2.1 黄芩素对HepG2细胞中胆汁外排转运体MRP2和BSEP的mRNA表达影响HepG2细胞与5 μmol·L-1 SFN、10、20、40 μmol·L-1的黄芩素共同孵育24 h后,5 μmol·L-1 SFN以及20、40 μmol·L-1的黄芩素组MRP2和BSEP的mRNA表达量有明显上调(P<0.05),提示黄芩素可以诱导MRP2和BSEP的mRNA表达。
2.2 黄芩素对HepG2细胞中胆汁外排转运体MRP2和BSEP蛋白表达影响HepG2细胞与5 μmol·L-1 SFN、10、20、40 μmol·L-1的黄芩素共同孵育24/48 h后,5 μmol·L-1 SFN以及10、20、40 μmol·L-1的黄芩素组结果显示,MRP2的蛋白表达量较空白对照组有明显上调,差异有显著性(P<0.05);BSEP的蛋白表达量则没有明显变化,差异无显著性。
2.3 黄芩素对HepG2细胞中Nrf2核转位的影响HepG2细胞与5 μmol·L-1 SFN、10、20、40 μmol·L-1的黄芩素共同孵育12 h后,5 μmol·L-1 SFN以及10、20、40 μmol·L-1的黄芩素组结果显示,HepG2细胞核内Nrf2蛋白量较空白对照组有明显增加。
3 讨论许多其他中药能诱导MRP2表达,促进胆汁外排,起到保肝利胆作用。如中药栀子的主要活性成分京尼平苷能有效增强MRP2介导的利胆作用,从而增强胆红素的清除,能有效的治疗胆汁淤积性疾病及黄疸性疾病[10];此外,川芎的主要活性成分四甲基吡嗪以及黄连解毒汤等中药制剂均可以通过调节MRP2的表达水平而起到利胆、改善胆汁淤积病症的作用[11]。茵陈蒿汤则能通过上调BSEP的表达,促进胆盐转运系统功能的恢复而治疗肝内胆汁淤积[12]。
本研究旨在考察黄芩中的主要活性成分黄芩素对MRP2和BSEP表达的影响。Real time PCR结果表明,在HepG2细胞中,黄芩素可以明显诱导MRP2和BSEP的 mRNA表达;Western blot结果显示,黄芩素能够诱导HepG2细胞中MRP2的蛋白表达,对BSEP的蛋白表达水平则无明显影响。同时还研究了黄芩素对Nrf2的作用,Western blot的结果表明黄芩素可以明显诱导HepG2细胞中Nrf2的核转位。在本研究中,HepG2细胞中Nrf2的核内蛋白转位与MRP2蛋白表达量的变化趋势一致,说明黄芩素对MRP2的调控作用可能与其促进Nrf2核转位有关,具体过程有待进一步研究。BSEP可以受到Nrf2和FXR的共同调控作用[13],黄芩素对BSEP表达的影响在mRNA水平和蛋白水平上出现了不一致的现象,这与BSEP受到转录后调节有关。
黄芩广泛的应用于临床上诸多利胆和治疗黄疸方剂中,本研究结果表明,黄芩素可以诱导MRP2和BSEP的基因表达以及MRP2的蛋白表达,MRP2和BSEP表达的增加可以增强肝细胞的外排功能,减少肝内胆汁中有毒成分的蓄积,这很可能是黄芩在诸多方剂中发挥作用的机制。
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