帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见于中老年人的慢性中枢神经系统退行性疾病。其病因及发病机制目前尚不完全清楚,目前主要认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。PD的主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元的进行性丢失及残存神经元中路易小体(lelly bodies)的形成。路易小体是以α-synuclein为主的多种蛋白聚集形成的包涵体。α-synuclein是脑内含量丰富的突触前蛋白,既参与正常突触功能的维持,又与多种神经退行性疾病有关,而且该蛋白的异常聚集与PD的发病密切相关[1],可成为抗PD药物研究作用的靶点。体外研究显示,金属离子可以促进α-synclein单体向纤维化聚集体的转变,其中Cu2+可以特异地与α-synuclein结合,形成Cu2+-α-synuclein复合物,促进α-synuclein的多聚化[2, 3]。
1 α-synuclein的结构特点人源α-synuclein是由140个氨基酸残基组成的可溶性小分子蛋白,主要分布于神经元突触前。正常情况下,它在溶液中没有二级结构,以无规则卷曲的形式存在,其氨基酸序列主要包括3个的区域(Fig1):① 氨基末端:由1~60个氨基酸残基组成,该区域的2/3的序列可以形成一系列双极性区域,包括4个不完全重复序列(xKTK(E/Q)GVxxxx共有基序),易形成两性α螺旋,介导其与含有酸性磷脂的膜结构及蛋白结合,促使α-synuclein蛋白的天然构象改变而发生错误折叠。② 中央疏水区域:包括61~95氨基酸序列,含有非β淀粉样成分(nonamyloid component,NAC)结构域。该区域由许多疏水性氨基酸残基组成,因而具有很强的疏水性,有形成β片层结构的趋向。其中该区域的第66~74位氨基酸残基(VGGAVVTGV)被称为“GAV”基序[4],是参与α-synuclein聚集必需成分。③ 羧基末端:体外实验发现羧基端缺失的α-synuclein更易聚集,主要原因是该区域富含脯氨酸等酸性氨基酸,带大量负电荷,带负电荷的氨基酸残基抑制了α-synuclein的聚集[5]。因此该区域对保持α-synuclein蛋白无规则卷曲的单体状态发挥关键作用。
2 α-synuclein的聚集由于α-synuclein的异常聚集,在PD患者体内形成了大量不溶性的Lewy bodies(路易小体)和Lewy neurite(路易神经突)[6]。α-synuclein在聚集过程中存在几种结构状态:无规则结构的单体、中间寡聚物、以及α-synuclein纤维状多聚体。首先在溶液中,单体的α-synuclein通过自身异常修饰或者相互作用,蛋白构象发生变化,由以α螺旋为主转变为富含β-折叠的寡聚化形式,这类寡聚体相互作用,最终转化为更加稳定的纤维化多聚体[7]。
异常聚集的α-synuclein是路易小体的主要组成成分,研究含有路易小体的神经元发现,胞质中α-synuclein的聚集体并不是对所有细胞都是有毒性,寡聚化的初原纤维(protofibrils)才是致病的主要原因,这类寡聚体富含β片层结构。Goldberg等[8]在2000年发表文章也认为,单体的α-synuclein对神经细胞是安全的,多聚化纤维形式的α-synculein毒性也较小,而α-synulein寡聚化的初原纤维构象才是最强的毒性形式,是α-synuclein致病的关键,而最终成熟的淀粉样纤维结构更可能是一种为保护细胞功能而形成的一种非活性结构。近年来研究者普遍认为α-synuclein寡聚体的毒性机制是由于富含β-折叠的寡聚体,可以与膜结合,在膜上形成孔环结构,从而增加细胞膜的通透性,引起钙离子内流、膜内包含物的外渗、线粒体膜去极化,进而引起细胞内生理代谢功能的紊乱,导致继发性的细胞死亡[9]。
3 Cu2+与α-synuclein的相互作用在生理状态下,金属离子不仅可以稳定蛋白质的结构,可以参与各种生物氧化还原反应,例如亲和催化、电子转移等,对生物体生存至关重要。然而,当金属离子和一些生物大分子相互作用或者发生异常的氧化还原反应则对机体产生很大的伤害[10]。
Cu2+在脑组织主要分布于基底神经节、海马、小脑以及皮层锥体神经元和小脑颗粒神经元的胞体和突触膜等区域。中枢神经系统中大量的酶发挥正常生理功能依赖Cu2+作为辅因子。Cu2+的代谢平衡对维持中枢神经系统的功能至关重要: Cu2+浓度过低可引起神经系统发育不完整,过量则会产生细胞毒性和神经损伤。Cu2+-蛋白相互作用以及Cu2+转运异常,都可能直接或间接地引发神经系统疾病。
随着年龄的增加,Cu2+在脑组织内的水平明显提高。1987年研究发现,在PD病人脑脊液中Cu2+浓度明显增高。Gorell等在1999年通过流行病学研究发现:长期接触金属铜、镁、或者铁等重金属的工人患PD的几率要比普通人高。Paik等[11]研究多种金属离子对α-synuclein自我寡聚化的影响,结果显示,相同条件下,与Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+相比,Cu2+诱导α-synculein聚集形成的寡聚体在Tricine/SDS/PAGE凝胶上呈现一系列梯状条带,其相对分子量分别为17、38、49、66、87、102和118 ku,如果把17 ku作为被除数,发现结果比值分别为1、2.2、2.9、3.9、5.1、6.0、6.9,证实了寡聚化的α-synculein是由单体α-synculein连续加聚产生的。与Cu2+诱导α-synculein特异性的寡聚不同,Fe2+却不能诱导蛋白的特异性聚集,在胶上呈现一条模糊的没有具体分子量的条带,与Cu2+形成鲜明的对比。
3.1 Cu2+与α-synculein的相互作用的亲和力很多研究表明,金属离子,尤其是Cu2+,可以通过影响α-synuclein在PD的发病中起一定作用。但α-synuclein与Cu2+的相互作用的亲和力、结合位点以及配位结构都不是很清楚。
最初在1999年,Paik所在实验室最先研究了α-synuclein与Cu2+的亲和力,结果显示,一个分子α-synuclein能结合5~10分子Cu2+,Kd(解离常数)值约为45~60 μmol·L-1。后来Binolfi等发现一分子单体α-synuclein只能结合两分子Cu2+:其中一分子的结合比较强,是一个高亲和力的结合,Kd值在0.1~50 μmol·L-1之间。
相比之下,α-synculein与第二分子Cu2+结合则在N末端识别出了2个解离常数为0.7和60 μmol·L-1的结合位点[12]。然而2009年,有研究人员通过荧光猝灭的方法发现了另一个解离常数为100 nmol·L-1的强的结合位点[13]。Hong等[14]采用等温滴定法,在野生型α-synculein中检测到一个解离常数为约0.2 nmol·L-1的亲和力更强的结合位点。
3.2 Cu2+与α-synuclein相互作用的结合位点金属离子与蛋白的结合位点主要存在于带负电荷的静电表面或者疏水性的表面,疏水性的环境可以增强金属与蛋白在表面上的相互作用[15]。到目前为止,关于Cu2+与α-synuclein的结合位点主要有N-末端区域、His-50以及带负电荷的C-末端区域。
目前学者一致认为,α-synuclein的N端结构域参与Cu2+的结合,该结构域含有与Cu2+结合的特异性位点。2004年,Rasia等[16]对Cu2+与α-synuclein的初始结合的位点进行了研究,研究发现,在α-synuclein N末端的3-9位氨基酸残基以及49-52位氨基酸残基存在着一个高亲和力的Cu2+结合位点,这几个氨基酸残基可以协调形成一个单一的Cu2+配位模式。它的特异性结合位点包括作为锚定残基的第50位的His氨基酸残基和一些位于四方形平面及不规则的四方几何上的N/O供体原子。
随后,Kowalik-Jankowska等[17, 18]在2006年通过电化学研究发现Cu2+与α-synuclein几个不同的结合位点可以相互配位,参与配位的基团有N-末端的氨基酸、Asp-2的骨架中的酰胺氮、His-50的咪唑基团以及Asp-2羧基端的氧原子,他们相互作用形成具有空间结构的配位复合物。以上研究结果和Lee等[19]在2008年的色氨酸荧光猝灭实验的结果是一致的,该学者也发现Cu2+与α-synuclein结合优先选择结合于N-末端区域的某些位点。但是通过NMR(nuclear magnetic resonance)研究的结果却恰恰相反,结果显示Cu2+与α-synuclein结合形成的复合物不是各结合位点相互配位的结构模式,而是分布在N末端、His-50以及C末端带负电荷的氨基酸残基的的一些独立的结合位点,彼此之间是没有关联的[20]。
关于His50以及C末端是否参与Cu2+与α-synuclein的结合一直存在着很大的争议。最初研究者认为C末端存在Cu2+结合的位点。然而进一步分析Cu2+与α-synuclein截断体表明,C末端虽然存在Cu2+与α-synuclein的结合位点,但是其结合是一个低亲和力的结合,C末端的119-123位的羧基可能是铜结合的有效结构域。Lee等[19]使用色氨酸荧光测量的方法得到了不同于前人的结果,他们认为通过Cu2+与α-synuclein的结合在N末端的高亲和力的结合位点既不包括第His-50的氨基酸参加,也没有第39位、94位、125位色氨酸,是通过相互靠近形成球形的多肽配位点。他们认为Cu2+与α-synuclein的紧密结合位点是包括Met-1的α-氨基酸、Asp-2的羧基、还有来自肽段骨架的去质子酰胺基和羧基组;他们还认为在富含羧基的C末端也可以配位等量的Cu2+,但是与N末端的结合相比,其亲和力则下降了近300倍。
3.3 Cu2+促进α-synuclein的聚集Cu2+是神经退行性疾病中研究最多的金属之一,它在不同的疾病中发挥着不同的生物学作用。如在AD和PD中,Cu2+可以破坏蛋白质的结构,发挥有害的作用。一方面,在PD患者中,Cu2+的氧化还原活性被认为是PD病理进展的一个重要因素,因为它能产生自由基和促进氧化还原活性。而且伴随着体内金属离子的失衡,由Cu2+诱导的α-synuclein的寡聚化增加也是PD等神经退行性疾病进展的关键所在。
Cu2+具有促使α-synuclein形成自身寡聚体的的作用,研究学者Brown等[21]研究所获得的数据显示,Cu2+同时结合α-synuclein的N-或C-末端时,会形成α-synuclein的寡聚体。而且全长α-synuclein与Cu2+特异性结合时,α-synuclein可以形成一个独特的寡聚体种类。这种寡聚体形式可能代表了α-synuclein毒性形式。接着他们通过处理形成聚集的α-synuclein,将合成的α-synuclein纤维、寡聚体及单体的混合物应用到SH-SY5Y细胞中,结果显示只有在Cu2+存在时,所形成的α-synuclein蛋白的聚集体才是有毒性的,由此表明Cu2+在α-synuclein介导的毒性作用中发挥关键性作用。
有研究人员认为细胞内寡聚体和胞内Cu2+的利用率相关,Cu2+诱导的α-synuclein的寡聚体可以引起细胞死亡。在低Cu2+浓度环境下,α-synuclein可以直接与膜结合;但是当Cu2+的水平升高时,α-synuclein的寡聚体形成增加而且聚集形成路易小体,从而导致细胞死亡造成细胞存活率的下降。这说明,当Cu2+浓度增加时,能与α-synuclein结合的Cu2+含量也增加,胞内的α-synuclein更容易变成有毒性的寡聚体形式。这种情况并不需要Cu2+的整体浓度升高,仅仅局部的可利用的Cu2+的浓度增加或者Cu2+结合α-synuclein的结合位点的增多便会发生[21]。蛋白质结构的稳定性与蛋白质构象发生的转变密切相关。曹剑等利用分子动力学模拟的方法揭示了Cu2+结合α-synuclein肽段可降低α-synuclein构象的自由能,极大地增加了其疏水残基的暴露程度,使得α-synuclein肽段因疏水作用更倾向于形成β-折叠片结构,从而诱导α-synuclein构象由无序向有序转变,驱动其疏水性聚集,使得α-synuclein肽段自聚集的概率增大。
金属催化的氧化反应参与了细胞死亡的过程。α-synuclein也是金属结合蛋白,可以参与金属离子介导的氧化还原反应。而且Cu2+与α-synuclein形成的复合物也有氧化还原活性。α-synuclein一方面可以与Cu2+结合,将Cu2+还原成Cu+,同时将分子氧催化形成氧化氢,形成ROS,对PD脑组织产生氧化损伤,ROS介导的细胞损伤是神经退行性疾病早期的病理变化之一,因此,α-synuclein与Cu2+结合产生的ROS造成的氧化应激也是PD的发病机制之一。
4 展望迄今为止,α-synuclein蛋白的生理功能并不清楚,目前研究的结果显示,α-synuclein对Cu2+的结合表现出极强的选择性。这表明α-synuclein可能具有Cu2+转运和平衡调控的功能。此外,α-synuclein的错误折叠需要在一定的环境条件,而脑组织中Cu2+浓度的局部升高则可以提供这一环境。因此研究Cu2+与α-synuclein相互作用特性以及由此引起的α-synuclein寡聚体增加对细胞造成的毒性,将有助于人们对α-synuclein生理功能的深入理解,使α-synuclein成为PD潜在的治疗靶点[22],并在分子水平上为阐明PD的发病机制提供更多的理论依据。
[1] | Breydo L, Wu J W, Uversky V N. Alphα-synuclein misfolding and Parkinson's disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1822 (2): 261-85. |
[2] | Uversky V N, Li J, Fink A L. Metal-triggered structural transformations, aggregation, and fibrillation of human alphα-synuclein. A possible molecular NK between Parkinson's disease and heavy metal exposure[J]. J Biol Chem, 2001, 276 (47): 44284-96. |
[3] | Myhre O, Utkilen H, Duale N, et al. Metal dyshomeostasis and inflammation in Alzheimer's and Parkinson's diseases: possible impact of environmental exposures[J]. Oxid Med Cell Longev, 2013, 2013 : 726954. |
[4] | Du H N, Tang L, Luo X Y, et al. A peptide motif consisting of glycine, alanine, and valine is required for the fibrillization and cytotoxicity of human alphα-synuclein[J]. Biochemistry, 2003, 42 (29): 8870-8. |
[5] | Murray I V, Giasson B I, Quinn S M, et al. Role of alphα-synuclein carboxy-terminus on fibril formation in vitro[J]. Biochemistry, 2003, 42 (28): 8530-40. |
[6] | Spillantini M G, Schmidt M L, Lee V M, et al. Alphα-synuclein in Lewy bodies[J]. Nature, 1997, 388 (6645): 839-40. |
[7] | Lee H J, Lee S J. Characterization of cytoplasmic alphα-synuclein aggregates. Fibril formation is tightly linked to the inclusion-forming process in cells[J]. J Biol Chem, 2002, 277 (50): 48976-83. |
[8] | Goldberg M S, Lansbury P T Jr. Is there a cause-and-effect relationship between alphα-synuclein fibrillization and Parkinson's disease?[J] Nat Cell Biol, 2000, 2 (7): E115-9. |
[9] | Danzer K M, Haasen D, Karow A R, et al. Different species of alphα-synuclein oligomers induce calcium influx and seeding[J]. J Neurosci, 2007, 27 (34): 9220-32. |
[10] | Sayre L M, Perry G, Smith M A. Redox metals and neurodegenerative disease[J]. Curr Opin Chem Biol, 1999, 3 (2): 220-5. |
[11] | Paik S R, Shin H J, Lee J H, et al. Copper(II)-induced self-oligomerization of alphα-synuclein[J]. Biochem J, 1999, 340 ( Pt 3): 821-8. |
[12] | Binolfi A, Lamberto G R, Duran R, et al. Site-specific interactions of Cu(II) with alpha and betα-synuclein: bridging the molecular gap between metal binding and aggregation[J]. J Am Chem Soc, 2008, 130 (35): 11801-12. |
[13] | Jackson M S, Lee J C. Identification of the minimal copper(II)-binding alphα-synuclein sequence[J]. Inorg Chem, 2009, 48 (19): 9303-7. |
[14] | Hong L, Simon J D. Binding of Cu(II) to human alphα-synucleins: comparison of wild type and the point mutations associated with the familial Parkinson's disease[J]. J Phys Chem B, 2009, 113 (28): 9551-61. |
[15] | Curtain C, Separovic F. Metals and membranes in neuroscience[J]. Eur Biophys J, 2008, 37 (3): 239. |
[16] | Rasia R M, Bertoncini C W, Marsh D, et al. Structural characterization of copper(II) binding to alphα-synuclein: Insights into the bioinorganic chemistry of Parkinson's disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 (12): 4294-9. |
[17] | Kowalik-Jankowska T, Rajewska A, Jankowska E, Grzonka Z. Copper(II) binding by fragments of alphα-synuclein containing M1-D2- and -H50-residues; a combined potentiometric and spectroscopic study[J]. Dalton Trans, 2006, 14 (42): 5068-76. |
[18] | Kowalik-Jankowska T, Rajewska A, Wisniewska K, et al. Coordination abilities of N-terminal fragments of alphα-synuclein towards copper(II) ions: a combined potentiometric and spectroscopic study[J]. J Inorg Biochem, 2005, 99 (12): 2282-91. |
[19] | Lee J C, Gray H B, Winkler J R. Copper(II) binding to alphα-synuclein, the Parkinson's protein[J]. J Am Chem Soc, 2008, 130 (22): 6898-9. |
[20] | Sung Y H, Rospigliosi C, Eliezer D. NMR mapping of copper binding sites in alphα-synuclein[J]. Biochim Biophys Acta, 2006, 1764 (1): 5-12. |
[21] | Brown D R. Oligomeric alphα-synuclein and its role in neuronal death[J]. IUBMB Life, 2010, 62 (5):334-9. |
[22] | 沈琮,张兰,李林.以α-synuclein为靶点的抗帕金森病药物研究进展[J].中国药理学通报 ,2014, 30 (2):149-53. Shen C,Zhang L,Li L.Advance in research on anti-Parkinson's disease drugs targeting α-synuclein. [J].Chin Pharmacol Bull,2014, 30 (2):149-53. |