半月板撕裂是膝关节常见损伤，常见于青年和老年人群，可导致膝关节疼痛和功能障碍^[1-2]，常用治疗方法为关节镜下部分半月板切除术（arthroscopic partial meniscectomy，APM）^[3]。但APM可改变半月板功能和生物力学，导致骨关节炎（osteoarthritis，OA）^[4-5]。OA具有高致残性，严重降低患者的生活质量^[6]。诱发OA的原因除机械负荷外，还与关节组织中促炎性和抗炎细胞因子、趋化因子、生长因子和脂肪因子的复杂相互作用密切相关。多种mRNA和信号通路参与OA的发病机制，包括Wnt通路、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路等^[7-10]。本研究拟探讨APM术后OA患者血浆mRNA表达特征，以识别参与OA发病机制的潜在基因标志物，并构建基因标志物评分模型用于评估APM术后患者OA发生风险。

1 材料与方法 1.1 一般资料

选取2019年1月至2021年12月间我院收治的半月板撕裂患者作为研究对象。纳入标准：年龄≥18岁，骨骼发育完全；首次APM治疗；膝关节无明确外伤史。排除标准：合并急性韧带断裂、骨折、风湿性及类风湿关节炎；伴有骨结核、骨肿瘤等骨病；既往膝关节手术史。最终共纳入268例。本研究获得我院医学伦理委员会批准（2020-LLLW-05）。所有患者或其家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 随访及OA评估

通过微信、电话、门诊检查等方式对APM术后患者随访3年。患者每年复查膝关节正侧位X线片，并依据Kellgren-Lawrence评分系统评估X线片表现。1级，可能有骨赘；2级，明确的骨赘和可能有关节间隙狭窄；3级，中度骨赘和明显关节间隙狭窄；4级，大骨赘，严重关节间隙狭窄或骨硬化。Kellgren-Lawrence评估分级≥2级定义为OA^[11]。

1.2.2 临床资料收集

包括一般资料，如年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、高血压病史、糖尿病史、高脂血症病史、吸烟史、饮酒史、既往关节损伤、OA家族史、工作类型、居住环境、教育水平、婚姻状况、日常锻炼、收缩压（systolic blood pressure，SBP）、舒张压（diastolic blood pressure，DBP），以及血液检查指标，如白细胞（white blood cell，WBC）、血小板（platelet，PLT）、葡萄糖（glucose，GLU）、载体蛋白A1和肌酸激酶（creatine kinase，CK）。

1.2.3 血浆mRNA提取及微阵列分析

收集患者术前1 d空腹外周静脉血10 mL，2 000 g离心2 min，分离血浆并置于液氮罐内冷冻备用。用TRIzol试剂提取血浆RNA，并通过SuperScriptⅢ RT试剂盒（美国ThermoFisher Scientific公司）逆转录为标记的cDNA。与微阵列芯片探针杂交后，洗去未结合cDNA，使用安捷伦扫描仪检测芯片荧光信号。使用Feature Extraction软件将扫描数据转换为数字信号，并进行标准化和归一化处理。

1.2.4 差异表达基因和生物学功能富集分析

使用R语言limma包分析mRNA微阵列差异表达基因，阈值设为|logFC| > 1和校正P < 0.05。将差异表达基因导入Enricher数据库（https://maayanlab.cloud/Enrichr/）中进行基因本体论（gene ontology，GO）、京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）及WikiPathway信号通路分析，并使用R语言dplyr包可视化。GO分析包括生物过程（bio-logical process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。

1.2.5 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析

使用STRING数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）构建差异表达基因PPI网络，置信度得分 > 0.4。将输出数据导入Cytoscape 3.8.0软件中，使用“cytoNCA”插件进行拓扑特征分析，并根据每个节点的度中心性（degree centrality，DC）和中介中心性（between centrality，BC）识别核心基因。网络评分和聚类查找的参数设置如下：度截止=2，节点分数截止=0.2，k-core=2，最大深度=100。

1.2.6 实时定量PCR

用TRIzol试剂提取血浆总RNA。使用gDNA Eraser PrimeScript RT试剂盒（日本TaKaRa公司）逆转录生成cDNA。用ABI7500定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）进行实时定量PCR，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，6℃退火30 s，40个循环。用GAPDH作内参，并使用2^-ΔΔCt法分析mRNA相对表达水平。PCR引物序列如下：COL1A1，正向5’-GCCTCCCAGAACATCACCTA-3’，反向5’-TGGGATGGAGGGAGTTTACA-3’；COL3A1，正向5’-TTCTCGCTCTGCTTCATCCC-3’，反向5’-TCCGCATAGGACTGACCAAG-3’；HLA-DRA，正向5’-GGACAAAGCCAACCTGGAAA-3’，反向5’-AGGACGTTGGGCTCTCTCAG-3’；PXDN，正向5’-TATGCGGGACGAGAACGAGA-3’，反向5’-ACTTAAACAACTCCGTAACAATACGAT-3’；GAPDH，正向5’-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3’，反向5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’。

1.2.7 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）

按照ELISA试剂盒（EK297-01，杭州联科生物技术有限公司）说明书操作分析蛋白表达水平。使用酶标仪在450 nm波长处检测光密度（optical density，OD）值，通过绘制标准曲线计算蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0、GraphPad Prism 9.5、Medcalc 22.0和Cytoscape 3.8.0软件进行统计学分析。计数资料用率（%）表示，组间比较采用χ²检验。计量资料用x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。采用受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析并计算相关变量曲线下面积（area under the curve，AUC）。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 2组患者临床资料比较

268例APM术后患者中，OA发生率为29.1%（78/268）。使用Matchit包，以年龄和性别进行倾向性评分匹配，最终匹配OA组和对照组患者各78例。OA组高血压比例、吸烟比例、BMI、SBP、PLT、GLU值均高于对照组（P < 0.05），OA组CK值低于对照组（P < 0.05）。见表 1。

2.2 2组患者微阵列、生物学功能富集及PPI网络分析

在OA组和对照组患者中随机选择6例进行血浆mRNA微阵列分析，结果显示，相较于对照组患者，OA组患者中104个基因表达下调，67个基因表达上调（图 1）。将171个差异表达基因导入Enricher数据库中，mRNA生物学功能富集分析结果显示，BP包括胶原纤维组织、破骨细胞分化的负调控、炎症反应的调节等；CC包括含胶原蛋白的细胞外基质、分泌颗粒腔、MHC蛋白复合物等；MF包括金属离子结合、RAGE受体结合、NF-κB结合等。KEGG主要富集在类风湿关节炎、库欣综合征和FoxO等信号通路中；Wikipathway主要富集在补体和凝血级联、TGF-β信号及OA软骨细胞肥大等信号中。PPI网络分析鉴定出7个OA相关枢纽基因：COL1A1、CD34、PXDN、PECAM1、HLA-DRA、COL3A1和APOE（图 1）。其在微阵列数据中表达热图见图 1B。

2.3 OA相关枢纽基因实时定量PCR验证

实时定量PCR结果（图 2）显示，与对照组相比，OA组患者中COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN表达增高，APOE、PECAM1和CD34表达无统计学差异。

2.4 血浆中COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN蛋白的表达特征

ELISA结果显示，与对照组患者相比，OA组患者血浆中COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN蛋白表达增加（P < 0.05），见图 3。

2.5 APM术后OA风险的多因素logistic回归分析

根据ELISA结果，对COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN表达进行多因素logistic回归分析，并根据β值构建基因标志物评分。评分=0.491×COL1A1表达量+0.011×COL3A1表达量+0.909×HLA-DRA表达量+0.004×PXDN表达量。将基因标志物评分、高血压、吸烟、BMI、SBP、PLT、GLU、CK进行多因素logistic回归分析，结果（表 2）显示，基因标志物评分、高血压、吸烟和BMI是APM术后OA风险的独立危险因素（P < 0.05）。

2.6 相关变量ROC曲线分析

ROC曲线分析结果显示，高血压、吸烟、BMI及基因标志物评分预测APM术后OA风险的AUC分别为0.572（0.490~0.650）、0.585（0.503~0.663）、0.703（0.625~0.773）和0.931（0.879~0.965）。见图 4。

3 讨论

OA是最常见的退行性关节疾病，多数半月板撕裂患者会发生OA或其他关节软骨退行性疾病，而APM术后患者OA发病率更高^{[8, 12]}。本研究针对APM术后OA的表观遗传机制研究空白，通过微阵列、实时定量PCR及WB发现COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN在OA患者血浆中呈高表达。基于此构建的基因标志物评分模型可用于评估APM术后OA发生风险，有助于早期识别高危人群并实施干预。

本研究通过血浆mRNA微阵列数据发现了171个差异表达基因与OA相关，功能富集分析显示这些基因主要富集在炎症反应调节、含胶原蛋白的细胞外基质、NF-κB结合、TGF-β信号、类风湿关节炎、库欣综合征、FoxO信号通路、补体和凝血级联及OA软骨细胞肥大等信号通路。这些信号通路大多参与OA发病机制，并发挥重要作用^[13-15]。炎症反应通过活性氧介导的氧化应激直接损伤软骨组织；细胞外基质降解伴随蛋白聚糖与胶原流失，削弱其机械支撑功能；NF-κB通路作为OA进程的核心调控因素，其激活可促进炎症、凋亡及细胞衰老等反应，是导致软骨破坏的关键驱动机制^{[8, 16-17]}。PPI网络分析从171个基因中获得7个OA相关基因，实时定量PCR验证发现，COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN是OA相关枢纽基因。ELISA分析证实COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN在OA患者血浆中表达增加。提示COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN可能是APM术后OA的潜在发病机制。

COL1A1和COL3A1均为胶原蛋白家族成员，是骨骼的主要成分。关节软骨中胶原-蛋白多糖网络降解破坏结构完整性，引发软骨细胞凋亡，导致关节间隙狭窄、骨面摩擦加剧，从而产生疼痛和活动受限，推动OA发展^[18-19]。COL1A1编码的Ⅰ型胶原增多可致软骨下骨间隙狭窄，加剧骨骼摩擦；COL3A1则通过与基质金属蛋白酶作用，调控PI3K/AKT、ECM受体及炎症信号通路，共同促进OA发展^[20-21]。HLA-DRA主要通过炎症反应和类风湿关节炎参与OA进展^[22]。PXDN是一种过氧化物酶，消耗过氧化氢催化多种底物氧化，增强氧化应激，加速软骨细胞端粒缩短和衰老，促进OA发生^[23-24]。

本研究基于COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN这4个OA相关基因构建基因标志物评分模型，多因素logistic回归显示该评分是APM术后OA发生的独立危险因素。ROC分析表明其预测性能显著优于常规临床变量，AUC达0.931（0.879~0.965），提示其具有更高的灵敏度和特异度，可用于早期识别高危患者并指导针对性干预。本研究存在以下局限：微阵列样本量有限；4个基因在OA中的具体机制尚需体内外实验进一步验证；较长随访期间可能存在混杂因素未完全控制，或导致结果偏倚。

综上所述，基于COL1A1、COL3A1、HLA-DRA和PXDN构建的基因标志物评分可有效预测OA风险，有利于协助临床医生识别ADM术后OA高风险患者。