2026, Vol. 55文章信息
- 彭志锋, 李加善, 张继红
- PENG Zhifeng, LI Jiashan, ZHANG Jihong
- 早期跑步通过HSPA5/PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬改善脑缺血小鼠的记忆功能
- Early running improves memory function in cerebral ischemic mice via mitochondrial autophagy mediated by the HSPA5/PINK1/Parkin signaling pathway
- 中国医科大学学报, 2026, 55(2): 122-126, 132
- Journal of China Medical University, 2026, 55(2): 122-126, 132
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文章历史
- 收稿日期：2025-01-06
- 网络出版时间：2026-01-08 17:03:53
引用本文 |
2. 山西大同大学医学院解剖教研室, 山西 大同 037009
2. Department of Anatomy, School of Medicine, Shanxi Datong University, Datong 037009, China
脑缺血会导致脑坏死、神经功能异常及死亡等严重后果。脑缺血损伤主要由兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症、氧化应激、钙超载和程序性细胞死亡等多种因素引起[1]。目前，临床上对脑缺血尚缺乏有效治疗措施。研究 [2]表明，缺血前、后进行体育运动可以减轻神经功能损伤并减少梗死体积，但其机制尚不明确。本课题组前期研究[3]证实，在脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）的小鼠模型中，热休克蛋白A5（heat shock protein A5，HSPA5）表达增加对I/R小鼠具有神经保护作用；I/R前侧脑室注射HSPA5 siRNA会导致I/R小鼠缺血半影区内神经元缺失加重。脑缺血早期跑步可通过上调缺血半影区HSPA5的表达促进I/R小鼠运动功能的恢复[3]，还可以通过调节细胞凋亡和自噬发挥神经保护作用[4]。在引起线粒体损伤的同时，I/R还能激活线粒体自噬机制，及时识别和清除受损线粒体和异常蛋白质，以调节线粒体功能并发挥神经保护作用[5]。
研究[6]发现PINK1和Parkin参与同一条基因通路，PINK1位于Parkin的上游，二者相互作用可触发线粒体自噬。PINK1和Parkin基因缺失可加重神经元损伤，提示PINK1/Parkin信号通路可能在I/R中发挥重要作用。本研究旨在探讨早期跑步对I/R小鼠记忆功能的影响，以及跑步是否可以通过HSPA5调节PINK1/Parkin介导的线粒体自噬发挥神经保护作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组SPF级雄性BALB-c小鼠（100~120 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠在温度和湿度控制的无病原体动物设施中饲养，标准12 h光照/12 h黑暗周期。将小鼠随机分为Sham组、跑步组、I/R组、跑步+I/R组、跑步+I/R+3-MA（自噬抑制剂）组、跑步+I/R+scramble siRNA组和跑步+I/R+HSPA5 siRNA组，每组8只。本研究获得山西大同大学研究伦理委员会批准（2022M0506）。
1.2 实验器材及试剂PCR仪（美国ABI公司）；电动跑步机、水迷宫（淮北正华生物仪器设备有限公司）；ELISA试剂盒、RNA提取试剂盒（上海星酶生物技术有限公司）；TTC染料、PINK1和Parkin抗体（美国Sigma公司）；HSPA5 siRNA、scramble siRNA（广州锐博生物技术有限公司）。
1.3 I/R模型制备腹腔注射1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉小鼠，在显微镜下解剖左侧颈总动脉并暴露颈总动脉分叉、颈外动脉和颈内动脉。随后，将直径为5 mm的线栓插入颈内动脉约18~20 mm，阻断大脑中动脉。除置入线栓外，Sham组的其余手术操作完全相同。脑缺血诱导1 h后，取出线栓并开始再灌注。在I/R后7 d处死小鼠，并提取缺血半影区用于后续实验。
1.4 跑步运动干预运动训练采用电动跑步机。参照文献[7]，I/R后48 h，跑步组、跑步+I/R组、跑步+I/R+3-MA组、跑步+I/R+scramble siRNA组和跑步+I/R+HSPA5 siRNA组小鼠在跑步机上进行为期5 d的跑步（30 min/d，15 m/min）。而Sham组和I/R组不进行任何训练。
1.5 侧脑室注射在I/R诱导后2 d，跑步+I/R+3-MA组、跑步+I/R+scramble siRNA组和跑步+I/R+HSPA5 siRNA组小鼠侧脑室分别注射3-MA、scramble siRNA和HSPA5 siRNA（2 μg/mL）。将小鼠麻醉后，放置于立体定位仪上，通过切开头皮中线，在右侧颅骨钻孔（位于脑桥后0.5 mm，脑桥外1.0 mm）。使用微量注射器以0.2 μL/min的速率将3-MA、scramble siRNA和HSPA5 siRNA缓慢注入右脑室。注射完成后，保持针头在位5 min，以防止漏液。之后在4 min内缓慢拔出针头，用骨蜡密封钻孔。
1.6 神经功能评分根据Longa的5分评分法[8]，在I/R后7 d对各组小鼠进行评分：0分，正常状态，无任何神经功能障碍；1分，站立时单侧前爪不能伸出；2分，向前爬行时小鼠表现出侧倾；3分，小鼠在爬行时侧卧；4分，小鼠失去意识或无法独立爬行。
1.7 TTC染色神经功能评分后，立即腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，4 ℃预冷生理盐水灌注心脏，快速取出缺血半影区脑组织进行冠状切片。在37 ℃、避光的情况下，用1% TTC染色15 min。染色后红色区域代表活细胞，苍白区域代表梗死。梗死体积（mm3）=染色区域面积（mm2）×厚度（mm）。计算每个标本脑梗死体积占全脑体积的百分比。
1.8 水迷宫实验术后7 d采用水迷宫检测小鼠的空间记忆能力，水迷宫直径120 cm，高度45 cm。逃生平台淹没在水面下1 cm。在进行水迷宫实验前，各组小鼠连续适应3 d，每天3 min。实验开始后，从目标象限相反的象限释放小鼠，并允许其进行60 s的平台搜索。记录每只小鼠在每个象限的停留时间和穿越平台的次数。
1.9 ELISA术后7 d，采用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中的炎性细胞因子水平，包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-10。
1.10 实时定量PCR术后7 d，收集各组小鼠缺血半影区。使用RNA提取试剂盒提取各组小鼠脑组织总RNA。使用分光光度计评估RNA水平以确定其纯度。随后，提取的RNA进行逆转录，并以GAPDH为内参，使用PCR仪测定HSPA5 mRNA表达水平。引物序列：GAPDH，正向5’-TGACGTGGACATCCGAAAG-3’，反向5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’；HSPA5，正向5’-GAGCAGGAGGAATTCCAGT-3’，反向5’-CTCCACGGCTTCCGATAACA-3’。使用2-ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达量。
1.11 Western blotting术后7 d，从缺血半影区采集脑组织样本，用适当的裂解液进行细胞裂解，得到的匀浆进一步通过超声波破碎处理，获得细胞质蛋白，使用BCA方法进行蛋白定量，添加Loading Buffer准备电泳样本。取30 μg样品进行SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜，5% 牛奶孵育1 h，加入PINK1和Parkin抗体（1∶500）孵育过夜，然后使用二抗（1∶4 000）在室温下孵育1 h，以β-actin为内参，使用ImageJ软件分析目的条带。
1.12 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey’s检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 早期跑步对I/R小鼠神经功能的影响与Sham组（0.0±0.0，0.0%±0.0%）相比，I/R组小鼠神经功能缺损评分（1.9±0.2）和脑梗死体积百分比（33.5%±3.7%）增加（P均 < 0.05），表明I/R模型成功建立。与I/R组相比，跑步+I/R组小鼠神经功能缺损评分（1.0±0.1）和脑梗死体积百分比（14.6%±1.8%）均降低（P均 < 0.05）。见图 1。
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| A, Sham group; B, running group; C, I/R group; D, running+I/R group. 图 1 各组小鼠缺血半影区TTC染色 Fig.1 TTC staining of the ischemic penumbra in each group of mice |
2.2 早期跑步对I/R小鼠记忆功能的影响
与Sham组相比，I/R组小鼠目标象限停留时间和穿越平台次数减少（P均 < 0.05）。与I/R组相比，跑步+I/R组小鼠目标象限停留时间和穿越平台次数增加（P均 < 0.05）。与跑步+I/R组相比，跑步+I/R+HSPA5 siRNA组小鼠目标象限停留时间和穿越平台次数减少（P均 < 0.05），跑步+I/R+3-MA组与跑步+I/R+HSPA5 siRNA组相比，无统计学差异。见表 1。
| Group | Target quadrant dwell time（s） | Platform crossing times |
| Sham | 12.5±1.3 | 3.0±0.3 |
| Running | 12.1±1.5 | 2.7±0.4 |
| I/R | 8.3±0.91） | 2.1±0.31） |
| Running+I/R | 11.9±1.52） | 2.8±0.32） |
| Running+I/R+3-MA | 9.1±1.11），3） | 2.2±0.21），3） |
| Running+I/R+scramble siRNA | 11.7±1.72） | 2.7±0.32） |
| Running+I/R+HSPA5 siRNA | 8.8±0.91），3） | 2.3±0.31），3） |
| 1）P < 0.05 vs. Sham group；2）P < 0.05 vs. I/R group；3）P < 0.05 vs. running+I/R group. | ||
2.3 早期跑步对I/R小鼠血清炎性细胞因子的影响
与Sham组相比，I/R组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平升高，而IL-10水平降低（P均 < 0.05）。与I/R组相比，跑步+I/R组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平下降，同时IL-10水平上升（P均 < 0.05）。与跑步+I/R组相比，跑步+I/R+HSPA5 siRNA组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平升高，而IL-10水平降低（P均 < 0.05）。见表 2。
| Group | TNF-α | IL-1β | IL-10 |
| Sham | 25.0±2.9 | 61.3±6.3 | 58.0±6.4 |
| Running | 26.4±3.1 | 62.1±6.8 | 59.2±6.2 |
| I/R | 225.3±24.61） | 132.5±14.21） | 28.5±3.31） |
| Running+I/R | 90.7±9.51），2） | 83.6±9.31），2） | 42.7±4.81），2） |
| Running+I/R+3-MA | 91.2±9.41），2） | 82.9±9.11），2） | 43.2±4.51），2） |
| Running+I/R+scramble siRNA | 92.3±9.61），2） | 83.5±9.01），2） | 44.1±4.31），2） |
| Running+I/R+HSPA5 siRNA | 145.7±15.51），2），3） | 113.2±12.31），2），3） | 31.6±3.41），3） |
| 1）P < 0.05 vs. Sham group；2）P < 0.05 vs. I/R group；3）P < 0.05 vs. running+I/R group. | |||
2.4 早期跑步对I/R小鼠HSPA5 mRNA表达影响
与Sham组（1.0±0.1）相比，I/R组小鼠HSPA5 mRNA表达（1.6±0.2）增加；与I/R组相比，跑步+I/R组小鼠HSPA5 mRNA表达（2.2±0.3）进一步增加（P均 < 0.05）。与跑步+I/R组相比，跑步+I/R+HSPA5 siRNA组小鼠HSPA5 mNRA表达（1.3±0.2）显著降低，（P < 0.05）。
2.5 早期跑步通过HSPA5调节PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬与Sham组相比，I/R组小鼠PINK1和Parkin表达上调（P均 < 0.05）；与I/R组相比，跑步+I/R组小鼠PINK1和Parkin表达进一步增加（P均 < 0.05）；与跑步+I/R组相比，跑步+I/R+3-MA组和跑步+I/R+HSPA5 siRNA组小鼠PINK1和Parkin表达降低（P均 < 0.05）。见图 2、表 3。
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| 1, Sham group; 2, running group; 3, I/R group; 4, running+I/R group; 5, running+I/R+3-MA group; 6, running+I/R+scramble siRNA group; 7, running+I/R+HSPA5 siRNA group. 图 2 各组小鼠缺血半影区PINK1和Parkin蛋白表达 Fig.2 Expression of PINK1 and Parkin proteins in the ischemic penumbra of mice in each group |
| Group | PINK1 | Parkin |
| Sham | 1.0±0.1 | 1.0±0.1 |
| Running | 1.0±0.1 | 1.1±0.1 |
| I/R | 1.8±0.21） | 1.7±0.21） |
| Running+I/R | 2.5±0.31），2） | 2.4±0.31），2） |
| Running+I/R+3-MA | 1.4±0.2 3） | 1.3±0.3 3） |
| Running+I/R+scramble siRNA | 2.4±0.31），2） | 2.3±0.31），2） |
| Running+I/R+HSPA5 siRNA | 1.2±0.22），3） | 1.2±0.32），3） |
| 1）P < 0.05 vs. Sham group；2）P < 0.05 vs. I/R group；3）P < 0.05 vs. running+I/R group. | ||
3 讨论
脑缺血为神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病和癫痫）功能障碍的促成因素之一[9]。研究[10]表明，运动是改善脑缺血患者运动功能障碍的重要途径，跑步机运动被证实为有效促进脑缺血后运动功能恢复的训练方案。
本研究结果显示，早期跑步可显著降低I/R小鼠神经功能缺损评分并减少脑梗死体积。此外，早期跑步可显著降低I/R小鼠血清TNF-α和IL-1β水平，同时升高IL-10水平。炎症反应在脑缺血后的继发性脑损伤中发挥至关重要的作用[11]。研究[12]发现运动预处理导致脑损伤大鼠血清TNF-α和IL-1β水平降低，IL-10水平升高，这与本研究的结果一致。
本研究结果显示，早期跑步可以改善I/R后的记忆功能。在缺血半影区，HSPA5增加可能是促进神经功能恢复的机制之一。作为热休克蛋白70家族的关键成员，HSPA5在细胞代谢和内质网功能中扮演重要角色，参与蛋白质折叠、修饰、细胞内外钙平衡调节并维持内环境稳定性[13]。在I/R小鼠模型中，HSPA5蛋白表达增加可能作为一种应激保护机制发挥神经保护作用；向I/R小鼠侧脑室注射HSPA5 siRNA可显著降低LC3-Ⅱ表达，导致缺血皮质神经元缺失，神经行为损伤加重，与自噬抑制剂3-MA的作用一致[14]。本研究结果显示，与跑步+I/R组相比，跑步+I/R+3-MA组和跑步+I/R+HSPA5 siRNA组小鼠记忆衰减均加重，同时提高了血清TNF-α和IL-1β的水平，降低了IL-10水平，提示早期跑步通过上调HPSA5改善I/R小鼠记忆功能及炎症反应。
I/R的病理生理学过程十分复杂，研究[15]发现线粒体自噬在其中发挥重要作用。PINK1和Parkin的协同作用可启动线粒体自噬，特异性清除受损线粒体，避免组织损伤[16]。因此，研究线粒体自噬相关蛋白PINK1/Parkin在I/R期间的表达和调控对研究缺血性脑卒中具有重要意义。本研究结果显示，与I/R组相比，跑步+I/R组小鼠PINK1和Parkin表达进一步增加；与跑步+I/R组相比，跑步+I/R+3-MA组和跑步+I/R+HSPA5 siRNA组小鼠PINK1和Parkin表达降低。这些结果表明，早期跑步通过上调HSPA5表达激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，从而改善I/R小鼠的记忆功能。
综上所述，早期跑步可以通过激活HSPA5介导的PINK1/Parkin信号通路改善I/R小鼠的记忆功能。然而，I/R过程中的线粒体自噬系统较为复杂，需要进一步的研究来阐明其他分子生物学机制。
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