呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV) 是婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的常见病原^[1]。RSV可激活机体免疫应答，诱导促炎性细胞因子表达。初始CD4⁺辅助性T细胞(T helper cell，Th) 0细胞可分化为Th1和Th2细胞。Th1细胞通过分泌γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、白细胞介素(interleukin，IL)-2和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α，TNF-α) 抑制炎症水平，Th2细胞则分泌IL-4、IL-5和IL-13促进炎症反应^[2]。据报道，Th1/Th2细胞失衡可诱导全身炎性细胞因子表达失调，在RSV感染肺炎中发挥重要作用^[3]。RSV感染肺炎患儿外周血Th1细胞比例和Th1/Th2值均低于健康人群^[4]；而调节Th1/Th2细胞平衡能显著改善RSV感染大鼠肺部炎症^[5]。

百蕊颗粒有清热、消炎及解毒功效，广泛用于气管炎和肺炎的治疗中^[6]。研究^[7]已证实百蕊颗粒能降低流感病毒感染小鼠血清炎症水平，然而其能否治疗RSV感染尚无报道。基于此，本研究拟探讨百蕊颗粒对RSV感染肺组织中Th1/Th2细胞平衡及相关细胞因子表达的影响，以期为中药治疗RSV感染提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 一般资料

选取2021年6月至2023年6月间贵州医科大学附属医院儿童呼吸科收治的80例确诊为RSV感染的肺炎患儿作为研究对象，并随机分为对照组和试验组，每组40例。纳入标准：符合《儿童呼吸道合胞病毒感染诊断、治疗及预防专家共识》 ^[8]中对RSV下呼吸道感染的诊断标准；通过鼻咽部脱落细胞检测确认为RSV阳性；患儿年龄≤5岁；病程≤4 d。排除标准：合并其他病原体感染；心脏、肝脏、肾脏功能障碍；支气管肺发育不良；就诊前7 d进行过对症治疗。本研究通过贵州医科大学附属医院伦理委员会批准(20230121)，患儿及家属均对本研究知情同意。

1.1.2 RSV病毒

RSV-Long毒株购自中国预防医学科学院病毒学研究所，RSV病毒传代后于-80 ℃冰箱保存。

1.1.3 实验动物

48只4周龄体重为60~70 g的SPF级雄性SD大鼠购自贵州中医药大学实验动物研究所，适应性饲养1周后进行实验。本研究获得贵州医科大学附属医院伦理委员会批准(20230227)。

1.1.4 药物和试剂

百蕊颗粒(国药准字Z20090694) 购自安徽九华华源药业有限公司；苏木素-伊红(hematoxylin eosin，HE) 染色试剂盒、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 试剂盒均购自上海碧云天生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 患儿治疗

对照组患儿进行常规对症治疗。当患儿血氧饱和度 < 96%时进行面罩吸氧；痰多难咳或痰鸣时使用排痰机排痰；体温 > 38.5 ℃时口服退热药；喘息或气道分泌物增多时雾化吸入异丙托溴铵溶液和布地奈德混悬剂。疗程7 d。试验组患儿在对照组基础上口服百蕊颗粒(0~< 3岁，2.5 g/次，3次/d；≥3岁，5 g/次，3次/d)。疗程7 d。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 流式细胞术检测

收集1 mL患儿外周血，加入红细胞裂解液裂解，以300 g离心10 min后收集沉淀，获得外周血单个核细胞。细胞中加入佛波酯和离子霉素刺激4 h后收集细胞。加入CYC-CD4室温孵育20 min，加入Cytofix/Cytoperm液4 ℃放置20 min，分别加入PE-IL-4、FITC-IFN-γ及同型对照抗体4 ℃避光孵育30 min，重悬细胞后用流式细胞仪检测。通过Cell Quest Pro软件进行数据采集和分析，IFN-γ⁺和IL-4⁺的散点图分别表示Th1、Th2细胞。

1.2.2.2 ELISA检测

收集4 mL患儿外周血，1 000 g离心5 min后分离血清，使用ELISA试剂盒检测血清IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13水平。通过酶标仪检测450 nm处吸光度值，代入标准曲线计算上述细胞因子水平。

1.2.3 患儿临床疗效评估

参照《儿童社区获得性肺炎管理指南》 ^[9]中的评定标准。显效，憋喘、咳嗽症状消失，肺部啰音消失；有效，憋喘、咳嗽症状减轻，肺部啰音范围减小；无效，憋喘、咳嗽症状及肺部啰音均无改善或恶化。总有效率=(显效+有效)例数/总例数×100%。

1.2.4 动物分组及模型制备

将48只4周龄大鼠随机分为空白组、RSV组、百蕊颗粒低剂量组和百蕊颗粒高剂量组，每组12只。采用RSV滴鼻制备RSV感染大鼠肺炎模型。除空白组外，其余各组大鼠两侧鼻孔均给予80 μL RSV (滴度为1×10⁷ PFU/mL) 滴鼻，空白组给予等量生理盐水，1次/d，连续滴鼻3 d。造模后，百蕊颗粒低、高剂量组大鼠分别给予1.35 g/kg、5.4 g/kg百蕊颗粒灌胃；空白组、RSV组大鼠给予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃5 d。治疗结束后测量大鼠体重；随后颈椎脱臼处死大鼠，剥离全肺并称重，计算肺系数。肺系数(%)=肺重/体重×10⁰。收集剩余大鼠肺组织备用。

1.2.5 指标检测

1.2.5.1 实时定量PCR检测

取大鼠肺组织，提取组织总RNA，使用Prime Script^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将RNA反转录为cDNA，SYBR Green试剂盒进行PCR扩增反应。以RSV特异性基因质粒构建标准曲线，通过Sequence Detection System软件分析各样本循环阈值，依据标准曲线计算样本中RSV基因拷贝数，代表肺组织RSV病毒载量。RSV引物序列：正向5’-TTAGTGACATTGATTTGCTAGTTGA-3’，反向5’-TTAGTGACATTGATTTGCTAGTTGA-3’。

1.2.5.2 HE染色

取大鼠肺组织，制备厚度约5 μm的石蜡切片并进行HE染色。通过光学显微镜观察肺组织病理损伤。

1.2.5.3 流式细胞术检测

取大鼠肺组织，匀浆后通过200目滤网收集细胞沉淀，利用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。制备淋巴细胞悬液，通过流式细胞术检测肺组织Th1、Th2细胞比例。方法同1.2.2.1。

1.2.5.4 ELISA检测

取大鼠肺组织，加入RIPA细胞裂解液裂解组织，12 000 g离心10 min后收集上清液，使用ELISA试剂盒检测肺组织IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13水平。方法同1.2.2.2。

1.3 统计学分析

采用SPSS 27.0软件进行统计学分析，计数资料以率(%) 表示，多组间比较采用χ²检验；计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 百蕊颗粒对患儿临床疗效的影响

临床疗效结果显示，对照组和试验组中，显效分别为9例(22.5%)、16例(40.0%)，有效分别为13例(32.5%)、18例(45.0%)，无效分别为18例(45.0%)、6例(15.0%)。2组患儿均得到有效治疗，但试验组治疗总有效率高于对照组(85.0% vs. 55.0%，P < 0.05)。

2.2 百蕊颗粒对患儿Th1/Th2细胞平衡及其相关细胞因子表达的影响

流式细胞术、ELISA检测结果显示，与治疗前比较，治疗后2组患儿外周血Th1细胞比例、Th1/Th2值升高，Th2细胞比例降低，血清IFN-γ、IL-2、TNF-α水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(P < 0.05)；且试验组患儿外周血Th1细胞比例、Th1/Th2值及血清IFN-γ、IL-2、TNF-α水平高于对照组，Th2细胞比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平低于对照组(P < 0.05)。见图 1。

2.3 百蕊颗粒对大鼠肺系数、肺组织病毒载量及肺损伤的影响

检测结果显示，与空白组比较，RSV组大鼠肺系数、肺组织病毒载量升高(P < 0.05)；与RSV组比较，百蕊颗粒低、高剂量组大鼠肺系数、肺组织病毒载量降低(P < 0.05)；且百蕊颗粒高剂量组上述效应优于低剂量组(P < 0.05)。

HE染色结果可见空白组大鼠肺组织结构完整，肺泡腔内无明显水肿、出血和炎症细胞浸润；RSV组大鼠肺组织结构紊乱，肺泡壁增厚，肺泡腔内可见明显水肿、出血和炎症细胞浸润；百蕊颗粒低、高剂量组大鼠肺组织结构基本完整，肺泡腔内可见少量水肿和炎症细胞浸润；且百蕊颗粒高剂量组上述效应优于低剂量组。见图 2。

2.4 百蕊颗粒对大鼠Th1/Th2细胞平衡及其相关细胞因子水平的影响

流式细胞术、ELISA结果显示，与空白组比较，RSV组大鼠肺组织Th1细胞比例、Th1/Th2值降低，Th2细胞比例升高，IFN-γ、IL-2、TNF-α水平降低，IL-4、IL-5、IL-13水平升高(P < 0.05)；与RSV组比较，百蕊颗粒低、高剂量组大鼠肺组织Th1细胞比例、Th1/Th2值升高，Th2细胞比例降低，IFN-γ、IL-2、TNF-α水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(P < 0.05)；且百蕊颗粒高剂量组上述效应优于低剂量组(P < 0.05)。见图 3。

3 讨论

RSV是婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体，目前缺乏特效药，临床亟需安全有效的治疗手段。百蕊颗粒作为具有清热消炎、化痰止咳功效的临床常用中药，已被证实对流感病毒性肺炎^[7]、肺炎支原体肺炎^[10]、细菌感染性肺炎^[11]均有明确疗效，但其在RSV感染中的作用尚未见报道。本研究通过临床与动物实验双维度证实百蕊颗粒可显著提升RSV感染患儿治疗总有效率，降低大鼠肺组织病毒载量并改善肺组织病理损伤，且高剂量组效果更优，这与百蕊草中黄酮苷、甘露醇等活性成分的抗菌、抗病毒及抗炎特性相符，为RSV感染的中药治疗提供了新的实践依据。

免疫应答紊乱是RSV感染后机体发病的重要因素。既往研究^[12]显示RSV感染会诱导Th1/Th2细胞失衡并向Th2方向偏移。Th2细胞分泌的IL-4、IL-5、IL-13等炎性细胞因子会加重气道黏膜损伤与肺部炎症；而Th1细胞分泌的IFN-γ、IL-2可通过增强细胞免疫促进病毒清除以减轻炎症水平^[13]。促进Th1细胞分化并抑制Th2细胞分化已被证实是缓解RSV所致肺部炎症的关键途径^[14]。本研究发现RSV感染患儿和大鼠模型中均存在Th1细胞比例及Th1相关细胞因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α) 水平降低，Th2细胞比例及Th2相关细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13) 水平升高的失衡状态；而百蕊颗粒可显著逆转这一趋势，不仅提高Th1/Th2比值，还同步调节相关细胞因子水平，且调节效应呈剂量依赖性。这与调节Th1/Th2细胞平衡可改善RSV感染的研究^[15]结论一致，进一步完善了中药干预RSV感染的免疫机制理论。

综上所述，百蕊颗粒对RSV感染的肺炎具有显著疗效，其机制可能是通过调节机体Th1/Th2细胞平衡及其相关细胞因子表达发挥作用。然而，本研究不足之处在于未深入探讨百蕊颗粒中具体活性成分(如黄酮苷、甘露醇) 调节Th1/Th2细胞平衡的分子通路，无法明确其核心作用靶点。今后将通过分子对接等技术深入挖掘百蕊颗粒活性成分调控Th1/Th2细胞平衡的关键通路，为百蕊颗粒的临床应用提供更充分的理论支持。