2026, Vol. 55文章信息
- 秦立鹏, 康婧, 贾培雷, 王凯, 薛松林
- QIN Lipeng, KANG Jing, JIA Peilei, WANG Kai, XUE Songlin
- 沉默PAK1通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胶质母细胞瘤细胞自噬发挥抗肿瘤效应
- Silencing PAK1 induces autophagy in glioblastoma cells to exert antitumor effects by blocking the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway
- 中国医科大学学报, 2026, 55(1): 41-47
- Journal of China Medical University, 2026, 55(1): 41-47
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文章历史
- 收稿日期：2024-12-31
- 网络出版时间：2026-01-06 09:26:27
引用本文 |
2. 石家庄市第三医院检验科，石家庄 050011;
3. 河北省胸科医院神经外科，石家庄 050041
2. Department of Laboratory Medicine, The Third Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, China;
3. Department of Neurosurgery, Hebei Provincial Chest Hospital, Shijiazhuang 050041, China
胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM) 是中枢神经系统中最常见的高度恶性原发性肿瘤，患者5年生存率仅约为10%[1]。目前临床治疗多采用手术、放疗和化疗等手段，但术后肿瘤易复发且不良反应明显[2]，亟需探索GBM新的治疗靶点与策略。p21活化激酶1 (p21-activated kinases 1，PAK1) 是丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸化激酶家族成员，与癌症的发生发展密切相关[3]。研究[4-5]表明，PAK1在黑色素瘤和皮肤T细胞淋巴瘤中高表达，能够促进肿瘤恶性进展，下调PAK1可发挥抗肿瘤效应。
PAK1在GBM组织中异常高表达[6]，但其是否能通过靶向磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR) 信号通路调控自噬参与GBM发展尚无报道。本研究通过体外实验探讨了PAK1调控该通路对GBM细胞自噬的影响及机制，旨在为GBM治疗靶点的开发提供参考。
1 材料与方法 1.1 数据库分析采用GEPIA数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/) 进行单基因分析，搜索PAK1基因，采用Boxplot分析207例GBM肿瘤组织和163例正常脑组织PAK1表达水平，采用Survival Plots分析PAK1表达水平和GBM患者(81例) 生存情况的相关性，纳入指标包括总生存期和无病生存期。
1.2 动物、细胞和主要试剂BALB/c裸鼠(3~4周龄、体重14~18 g) 购自四川维通利华实验动物技术有限公司，生产许可号SCXK (川) 2023-0040。实验动物在SPF级环境中饲养，环境温度维持在18~22 ℃、湿度50%~60%，饲料均经灭菌处理。人正常胶质细胞系NHA、人GBM细胞系(T98G、U87MG、U251、A172、SHG44) 购自武汉普诺赛生命科技有限公司；CCK-8试剂盒、结晶紫染液购自北京索莱宝生物科技有限公司；一步法实时定量PCR试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；一抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p62、Beclin-1、和微管相关蛋白1轻链3 (membrane-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ购自英国abcam公司。本研究获得河北省中医院动物试验中心动物伦理委员会批准(20240016)。
1.3 细胞培养、转染和分组所有细胞采用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS) 的DMEM培养基，于37 ℃、含5% CO2培养箱中常规培养。将对数期U251细胞接种至6孔板(5×105/孔) 中，置于培养箱中过夜。次日弃去孔板中原培养基，使用2.5 μL lipo8000转染试剂联合50 μL Opti MEM培养基将1.25 μg 25 μmol/L的si-PAK1或si-NC转染至细胞中，另取未处理的U251细胞作为空白对照(Blank) 组，培养48 h后，收集细胞实时定量PCR法检测PAK1的转染效率。
将U251细胞分为si-NC组(转染si-NC)、si-PAK1组(转染si-PAK1)、si-PAK1+740Y-P组(转染si-PAK1后，加入30 μmol/L通路激活剂740Y-P [7]) 和si-PAK1+CHQ组(转染si-PAK1后，加入3 μmol/L自噬抑制剂氯喹[8])。
1.4 CCK-8法收集各组U251细胞，以5×103/孔接种至96孔细胞培养板中，每组设置3个重复孔。置于培养箱中培养0、24、48、72 h，在相应培养板中加入CCK-8溶液(10 μL/孔) 后孵育1 h，酶标仪450 nm处测定吸光度(absorbance，A) 值。实验独立重复3次。
1.5 平板克隆法收集各组U251细胞，以500/孔接种至6孔细胞培养板中，待大部分细胞克隆团数量≥50时终止培养。加入4%多聚甲醛室温固定15 min，加入1 μg/mL结晶紫染色液室温孵育10 min，晾干后拍照并用ImageJ软件分析每组细胞克隆团数量。实验独立重复3次。
1.6 Trasnwell小室法收集各组U251细胞，用不含FBS的DMEM培养基制备浓度为2.5×105/mL的细胞悬液，取200 μL加入到小室，下室加入800 μL含有10%FBS DMEM培养基，培养24 h后，取出小室浸于4%多聚甲醛中固定15 min，结晶紫染液(1 μg/mL) 染色10 min，用棉签擦除小室上方未穿过的细胞。在显微镜下随机选取5个视野拍照计数并取平均值。用预包被Matrigel基质胶的Transwell小室重复上述操作后，计数侵袭细胞数量。实验独立重复3次。
1.7 流式细胞术收集各组U251细胞，加入200 μL PBS液调整细胞浓度至5×105/mL。取100 μL细胞悬液加入5 μL Annexin V-FITC染液和5 μL 50 μg/mL碘化丙啶染液，室温避光孵育20 min，1 h内上机检测各组细胞凋亡率。仪器参数设置：激光光源488 nm蓝激光，FITC通道530 nm带通绿光片检测绿色荧光，PI通道670 nm长通滤光片检测红色荧光。分析时以FSC/SSC圈定主细胞群，总凋亡率为右上象限早期凋亡细胞+右下象限晚期凋亡细胞占比。实验独立重复3次。
1.8 实时定量PCR利用TRIzol从各组U251细胞中提取总RNA，使用一步法实时定量PCR试剂盒进行反转录，使用荧光定量PCR仪检测。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算细胞中PAK1 mRNA表达。实时定量PCR引物设计针对PAK1基因选择其第5与第6外显子交界区序列。PAK1，正向5’-CAGCCCCTCCGATGAGAAATA-3’，反向5’-CAAAACCGACATGAATTGTGTGT-3’；GAPDH，正向5’-CCATCAATGACCCCTTCATTG-3’，反向5’-CATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’。实验独立重复3次。
1.9 Western blotting利用预冷的RIPA裂解液裂解各组U251细胞，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min后取上清，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白经电泳分离后转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃过夜孵育一抗GAPDH (1∶2 000)、p-PI3K (1∶500)、p-AKT (1∶500)、p-mTOR (1∶500)、PI3K (1∶500)、AKT (1∶500)、mTOR (1∶500)、p62 (1∶500)、Beclin-1 (1∶500) 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ (1∶500)。加入二抗(1∶5 000) 室温孵育1 h。增强型化学发光剂显影成像，采用ImageJ软件分析目的蛋白条带灰度值。实验独立重复3次。
1.10 裸鼠实验将16只裸鼠随机分为si-NC组和si-PAK1组(每组8只，雌雄各半)。通过胰蛋白酶消化法制备细胞悬液，调整细胞密度至1×105/mL。消毒裸鼠局部皮肤后，每只小鼠大腿末端根部注射0.5 mL细胞悬液。观察裸鼠一般状态及接种部位局部情况，每周用游标卡尺测量肿瘤体积，接种6周后实施安乐死。分离肿瘤标本、称重，绘制肿瘤生长曲线并比较各组肿瘤重量。
1.11 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，用Shapiro-Wilk检验确认数据正态性分布，Levene检验验证方差齐性。若不符合正态分布或方差不齐，则使用非参数检验；若满足正态分布且方差齐，则采用单因素方差分析多组间数据，两两比较采用LSD-t法。对于不同时间、不同组别间细胞活力的比较采用重复测量分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 PAK1在GBM组织中的表达及与预后的相关性GEPIA数据库分析结果显示，与正常脑组织比较，GBM组织中PAK1 mRNA表达升高(P < 0.05)，见图 1A。与PAK1高表达组比较，PAK1低表达组的GBM患者总生存期增加，但无统计学差异(P > 0.05)，见图 1B；无病生存期增加，差异有统计学意义(P < 0.05)，见图 1C。提示PAK1低表达组GBM患者预后更好。
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| A, expression of PAK1 in normal brain tissue and GBM tissue; B, correlation between PAK1 expression and overall survival; C, correlation between PAK1 expression and disease-free survival. *P < 0.05. 图 1 PAK1在GBM组织中的表达及其与各生存期的相关性 Fig.1 Expression of PAK1 in GBM tissue and its correlation with different survival periods |
2.2 不同细胞系和转染后细胞中PAK1 mRNA表达水平
与人正常胶质细胞系NHA比较，人GBM细胞系(T98G、U87MG、U251、A172、SHG44) 中PAK1 mRNA表达升高(P < 0.05)，且U251细胞中PAK1 mRNA表达水平最高，故选择U251细胞作为后续实验细胞。与Blank组和si-NC组比较，si-PAK1组细胞中PAK1 mRNA表达降低(P < 0.05)，提示沉默PAK1成功。见图 2。
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| A, PAK1 mRNA expression levels in different cell lines; B, PAK1 mRNA expression levels in U251 cells following transfection. *P < 0.05 vs. NHA cell; #P < 0.05 vs. U251 cell; & P < 0.05 vs. blank group, △P < 0.05 vs. si-NC group. 图 2 不同细胞系中PAK1 mRNA表达水平 Fig.2 PAK1 mRNA expression levels in different cell lines |
2.3 各组细胞增殖情况
与si-NC组比较，si-PAK1组细胞活力、克隆团数量降低(P < 0.05)；与si-PAK1组比较，si-PAK1+740Y-P组或si-PAK1+CHQ组细胞活力、克隆团数量升高(P < 0.05)。见图 3。
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| A, A450 values of U251 cells in each group at 0, 24, 48, and 72 hours; B, number of colony-forming cells in each group; C, crystal violet staining images from the plate-count assay for U251 cells in each group. *P < 0.05 vs. si-NC group; #P < 0.05 vs. si-PAK1 group. 图 3 各组细胞增殖情况 Fig.3 Cell proliferation in each group |
2.4 各组细胞迁移及侵袭能力
与si-NC组比较，si-PAK1组细胞迁移及侵袭数量减少(P < 0.05)；与si-PAK1组比较，si-PAK1+740Y-P组或si-PAK1+CHQ组细胞迁移及侵袭数量增多(P < 0.05)。见表 1、图 4。
| Group | n | Number of migrations | Number of invasions |
| si-NC | 3 | 230±15 | 115±7 |
| si-PAK1 | 3 | 47±41) | 9±21) |
| si-PAK1+740Y-P | 3 | 148±72) | 63±52) |
| si-PAK1+CHQ | 3 | 155±92) | 72±82) |
| 1) P < 0.05 vs. si-NC group；2) P < 0.05 vs. si-PAK1 group. | |||
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| 图 4 各组细胞迁移及侵袭数量×200 Fig.4 Cell migration and invasion counts in each group ×200 |
2.5 各组细胞凋亡率
与si-NC组(1.23%±0.05%) 比较，si-PAK1组细胞凋亡率(27.68%±3.21%) 升高(P < 0.05)；与si-PAK1组比较，si-PAK1+740Y-P组(10.01%±1.25%) 和si-PAK1+CHQ组(12.58%±1.78%) 细胞凋亡率降低(P < 0.05)。见图 5。
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| 图 5 各组细胞凋亡率 Fig.5 Apoptosis rates in each group |
2.6 各组细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路和自噬相关蛋白表达水平
与si-NC组比较，si-PAK1组p62蛋白表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR值降低(P < 0.05)，Beclin-1蛋白表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值升高(P < 0.05)；与si-PAK1组比较，si-PAK1+740Y-P组或si-PAK1+CHQ组p62蛋白表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR值升高(P < 0.05)，Beclin-1蛋白表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值降低(P < 0.05)。见图 6。
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| A, electrophoretic patterns of PI3K/AKT/mTOR pathway and autophagy-related proteins in each group; B, expression levels of PI3K/AKT/mTOR pathway-related proteins in each group; C, expression levels of autophagy-related proteins in each group. *P < 0.05 vs. si-NC group; #P < 0.05 vs. si-PAK1 group. 图 6 各组PI3K/AKT/mTOR信号通路和自噬相关蛋白表达 Fig.6 Expression of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and autophagy-related proteins in each group |
2.7 各组荷瘤裸鼠移植瘤肿瘤生长情况
荷瘤裸鼠接种部位均可见明显肿瘤，表现为皮下结节，初期呈椭圆形，随后逐渐发展为不规则、凹凸不平的分叶状结构。6周的裸鼠移植瘤生长曲线监测结果显示，与si-NC组相比，si-PAK1组的移植瘤生长速度显著降低，且肿瘤重量明显减少(均P < 0.05)。见图 7。
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| A, tumor growth curve of nude mice in each group; B, tumor volume of nude mice in each group; C, tumor weights of nude mice in each group. *P < 0.05 vs. si-NC group. 图 7 各组荷瘤裸鼠移植瘤肿瘤生长 Fig.7 Tumor growth in xenograft models of nude mice in each group |
3 讨论
GBM是成人中最常见且恶性程度极高的颅内恶性肿瘤，由于血脑屏障阻碍药物传递，临床多采用手术方式进行肿瘤切除，但术后易复发且预后不佳。因此，发现与GBM发展和预后相关的生物标志物并探索其分子机制，对GBM的治疗有重要意义。
PAK1作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在肿瘤增殖、凋亡、侵袭等过程中发挥关键作用。研究[9-10]表明，PAK1在胰腺癌、非小细胞肺癌中异常高表达；沉默PAK1可抑制非小细胞肺癌细胞及GBM细胞U87的增殖和侵袭，还能在体内抑制U87细胞移植诱导的肿瘤形成[11-12]。GEPIA数据分析结果显示，GBM组织中PAK1 mRNA表达水平明显高于正常脑组织。本研究中，GBM细胞PAK1 mRNA表达明显高于正常胶质细胞，沉默PAK1可抑制人GBM U251细胞的恶性进展，下调p62蛋白表达，上调Beclin-1蛋白表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值，表明沉默PAK1可诱导细胞自噬，发挥抗肿瘤效应，但具体机制需进一步验证。
肿瘤细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路与自噬关系密切，PI3K可激活AKT，之后通过一系列的调控使mTOR磷酸化，从而抑制自噬[13]。此外，许多肿瘤相关基因与PI3K/AKT/mTOR信号通路共同对细胞自噬进行调节，进而调控增殖、迁移及侵袭、凋亡等生理进程。如去糖基化EpCAM通过阻断PI3K/Akt/mTOR通路增强自噬抑制癌细胞增殖[14]；抑癌基因LACTB可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进自噬抑制结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭[15]；而FAM83D作为肿瘤促进因子发挥作用，沉默FAM83D可通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导自噬，从而抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭[16]。本研究结果显示，沉默PAK1可阻断U251细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路并诱导自噬；联合PI3K/AKT/mTOR信号通路激活剂740Y-P或自噬抑制剂CHQ处理后，可重新激活PI3K/AKT/mTOR信号通路并抑制自噬，逆转沉默PAK1对U251细胞的增殖、迁移及侵袭抑制和凋亡促进作用。以上结果说明沉默PAK1抑制GBM恶性进展的作用可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路以诱导细胞自噬有关。
综上所述，沉默PAK1能够抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路以诱导细胞自噬，进而在GBM中发挥抗肿瘤效应。但本研究存在一定局限性：(1) 缺乏多细胞系及原代细胞验证；(2) 未探讨与其他信号通路的交互作用；(3) 未进行更直接的自噬通量检测。未来将拓展至多种GBM细胞系和动物模型，增设过表达组完善验证，并结合数据库与临床样本评估PAK1作为治疗靶点的可行性，为GBM精准治疗提供更全面的依据。
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