骨关节炎（osteoarthritis，OA）以关节退行性病变为特征^[1]。目前普遍认为软骨退变是OA最明显、最典型的病理改变，但其发病机制尚未完全清楚。OA的进展与炎症相关，其中以滑膜炎为代表。白细胞介素（interleukin，IL）-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-6等炎症介质在滑膜炎症过程中合成^[2]。研究^[3]报道，IL-1β可显著诱导软骨细胞中铁死亡蛋白上调，而抑制铁死亡蛋白可促进OA病理进展过程中软骨细胞的存活和软骨基质的合成。因此，软骨细胞铁死亡被视为OA的治疗靶点。姜黄素（curcumin，CUR）是从姜黄根茎中提取的多酚类色素，已被广泛用于中医药中，以缓解患者的炎症和改善退行性病变^[4]。此外，CUR对OA的作用主要表现为促进胶原合成和阻碍炎性细胞因子分解^[5]。尽管研究取得了进展，但CUR治疗OA的机制仍不清楚。因此，本研究探讨了CUR能否减轻OA的软骨细胞炎症和软骨降解及其潜在机制，以期为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

CUR，购自上海源叶生物科技有限公司；去铁胺（deferoxamine，DFO），购自美国Sigma公司；CCK-8试剂盒，购自美国BOSTER公司；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），购自美国MedChemExpress公司；环氧化酶-2（cyclooxygenase- 2，COX-2）、Ⅱ型胶原蛋白α链（collagen type Ⅱ α，COL2A），购自德国Merck公司；基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）、p53、溶质转运蛋白家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11），购自英国abcam公司；二抗，购自武汉赛维尔生物科技有限公司；铁比色测定试剂盒，购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.2 实验动物分组和OA模型建立

40只SD大鼠（8周龄，雄性，180~220 g），购自常州卡文斯实验动物有限公司。将大鼠随机分为假手术组、OA组、CUR+OA组、DFO+OA组，每组10只。OA组、CUR+OA组、DFO+OA组大鼠通过右膝前交叉韧带处理和内侧半月板失稳法建立OA模型^[6]；假手术组大鼠打开右膝关节囊暴露关节腔后，用器械轻触韧带或半月板（不造成结构性破坏），保持操作时间与真实手术一致。CUR组和DFO组大鼠术后关节腔内分别注射20 μmol/L CUR和10 μmol/L DFO，1次/周；OA组和假手术组大鼠术后关节腔内注射等体积生理盐水。大鼠术后均进行1 h的滚跑训练，3次/周。术后8周处死所有大鼠。本研究获得我院医学伦理委员会批准（JGSU2022-0152）。

1.3 细胞培养和分组

软骨细胞获自5日龄SD大鼠^[7]。从50只5日龄乳鼠膝关节软骨组织提取原代软骨细胞进行初代培养，每只鼠约获得0.5×105~1×105个细胞。细胞培养于37℃、5%CO2条件下，将细胞分为对照组、IL-1β组、CUR+IL-1β组、DFO+IL-1β组，分别在细胞中加入溶剂混合液、IL-1β、CUR和IL-1β、铁死亡蛋白抑制剂DFO和IL-1β。

1.4 细胞实验

1.4.1 CCK-8实验

采用CCK-8法测定细胞活力。将大鼠软骨细胞以1×104/孔的密度接种到96孔板。用不同浓度的CUR（0、1、5、10、20、30和40 μmol/L）单独处理或与IL-1β（10 ng/mL）联合处理24 h后加入CCK-8试剂，测定450 nm处的吸光度。

1.4.2 甲苯胺蓝和阿尔新蓝染色

甲苯胺蓝常被用于鉴定软骨细胞。阿尔新蓝是酸性黏液最特异的染料。2种染色均使用24孔板进行。用4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤3次后，在室温下与染料孵育6 h。用PBS冲洗3次，在Evos FL Auto倒置显微镜（美国ThermoFisher Scientific公司）下观察。

1.4.3 线粒体膜电位检测和透射电子显微镜检查

1.4.3.1 线粒体膜电位检测

进行JC-1染色，37 ℃孵育20 min，检测线粒体膜电位变化。

1.4.3.2 透射电子显微镜检查

经1%四氧化锇和2%醋酸铀固定染色，梯度脱水后与树脂混合、包埋，超薄切片经醋酸铀-柠檬酸铅双染色，TECNAI G20透射电镜（美国ThermoFisher Scientific公司）下观察线粒体超微结构。

1.4.4 铁死亡相关指标检测

1.4.4.1 GPX4检测

将软骨细胞接种到24孔板，采用免疫荧光检测GPX4蛋白水平，在Evos FL Auto荧光显微镜（美国ThermoFisher Scientific公司）下观察，评估细胞抗脂质过氧化能力。

1.4.4.2 活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测

细胞与10 μmol/L DCFH-DA于37 ℃共孵育20 min，在Evos FL Auto荧光显微镜下检测绿色荧光强度。

1.4.4.3 线粒体铁染色

Mito-FerroGreen探针于37 ℃孵育15~45 min，在Evos FL Auto荧光显微镜下观察。

1.4.4.4 脂质ROS检测

细胞与5 μmol/L C11 BODIPY于37 ℃孵育1 h，PBS洗涤后，在Evos FL Auto荧光显微镜下观察，计算红绿荧光比值，评估脂质过氧化程度。

1.4.5 细胞内铁测定

用裂解缓冲液（200 μL/孔）裂解细胞，然后加入铁离子检测试剂30 μL，混匀，室温孵育30 min，置于96孔板中，测定550 nm处的吸光度。

1.4.6 谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定

按照微量还原型GSH检测试剂盒和MDA检测试剂盒说明，细胞用PBS洗涤2次，加入1 mL RIPA进行超声处理，离心10 min，收集上清液，波长为412 nm，在酶标仪下加入试剂，检测细胞中还原型GSH和MDA的含量。

1.5 动物实验

1.5.1 组织学染色

将膝关节冠状面切成5 μm厚的切片，进行HE和番红O-固绿染色。使用COL2A和SLC7A11的抗体进免疫组织化学染色。

1.5.2 Western blotting

收集动物实验中大鼠软骨组织以及细胞实验中培养的软骨细胞，提取蛋白，将蛋白质样品在凝胶上分离，转移到PVDF膜上。将膜在室温下封闭1 h，然后与1∶1 000稀释的iNOS、COX-2、MMP13、p53、SLC7A11和GPX4一抗在4 ℃孵育过夜。洗膜后，与相应的二抗（1∶5 000稀释）孵育1 h。使用增强型ECL试剂盒对蛋白条带进行可视化。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism8.0处理数据。计量资料以x±s表示，2组间比较采用Student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CUR对细胞活力的影响

CCK-8实验结果（图 1A）显示，10、20、30 μmol/L CUR对大鼠软骨细胞无毒性，10 μmol/L CUR作用下细胞活力增加。在IL-1β刺激下，10 μmol/L CUR显著恢复细胞活性（图 1B）。故后续实验选用10 μmol/L CUR。

2.2 CUR和DFO均可恢复IL-1β诱导的软骨细胞炎症反应和细胞外基质降解，并改善IL-1β诱导的铁死亡中线粒体损伤

通过甲苯胺蓝染色确认软骨细胞表型（图 2A）。阿尔新蓝染色结果（图 2B）显示，IL-1β诱导黏多糖降解，而CUR和DFO可将其逆转。IL-1β上调炎性细胞因子iNOS、COX-2以及MMP13，促进COL2A降解，CUR和DFO均能抑制这些变化（图 2C）。IL-1β组红色/绿色荧光比值降低，线粒体损伤增加，并导致线粒体皱缩、外膜破裂和嵴结构减少（图 2D~2E）。CUR和DFO可部分逆转这些损伤，恢复线粒体形态和功能（图 2D）。结果表明，二者可能通过保护线粒体完整性，减轻IL-1β诱导的软骨细胞损伤（图 2E）。

2.3 CUR和DFO改善细胞内铁和ROS水平升高并减轻IL-1β诱导的GPX4抑制

IL-1β诱导细胞内铁水平升高，促进ROS和脂质ROS产生，抑制GPX4表达。与对照组相比，IL-1β组中绿色荧光强度显著增强，CUR和DFO组中这一现象逆转。表明CUR和DFO改善了细胞内铁和ROS水平升高，减轻了IL-1β诱导的GPX4抑制。见表 1。

2.4 CUR和DFO通过p53/SLC7A11/GPX4信号通路减轻软骨细胞铁死亡

在IL-1β诱导的软骨细胞裂解物中，GSH表达水平降低，细胞内铁和MDA水平升高（表 1），与免疫荧光检测结果一致。CUR和DFO逆转并减轻了IL-1β诱导的软骨细胞铁死亡（图 3）。

2.5 CUR和DFO减轻OA大鼠软骨降解

通过HE和番红O-固绿染色观察组织形态学差异。与假手术组大鼠相比，OA组大鼠出现明显的软骨损伤，包括表面侵蚀、软骨细胞序列紊乱和蛋白多糖损失。CUR+OA组和DFO+OA组大鼠的软骨损伤明显减轻（图 4A、4B）。免疫组织化学染色结果（图 4C、4D）显示，与假手术组相比，OA组大鼠关节软骨中COL2A和SLC7A11阳性表达显著减少，而CUR+OA组和DFO+OA组大鼠关节软骨中COL2A和SLC7A11阳性表达显著增加。与细胞实验结果一致，在OA大鼠模型中，CUR和DFO通过抑制铁死亡，表现出对软骨退化的保护作用。

3 讨论

关节软骨自我修复能力极差，其退化是OA发展的关键因素。研究发现，CUR可通过上调Prdx6蛋白表达抑制软骨细胞铁死亡。因此，本研究探究了CUR是否通过铁死亡途径发挥OA保护作用。

人们普遍认为，OA的进展与炎症密切相关。OA中的炎症标志物iNOS和COX-2能增加一氧化氮和前列腺素的释放，可促进分解代谢酶，导致OA中软骨稳态失衡^[8]。IL-1β作为一种代表性炎性细胞因子，在OA中显著升高，被广泛用作体外OA的诱导剂^[9]。因此，本研究采用IL-1β诱导OA病理模型。研究发现，IL-1β诱导COX-2、iNOS和MMP13的产生，减少COL2A的产生。此外，IL-1β促进软骨细胞铁死亡，能够抑制SLC7A11和GPX4，诱导p53过度表达，引起细胞内脂质ROS和ROS积累，增加MDA的产生。这些结果表明，IL-1β诱导的软骨细胞发生了铁死亡，而这些效应可以被CUR逆转。此外，铁死亡抑制剂DFO表现出与CUR相同的作用。表明CUR有助于减轻OA软骨退化，这可能与铁死亡有关。

铁死亡是一种与脂质过氧化有关的铁依赖性细胞死亡。在OA中，关节中存在过量的铁，可诱导氧化应激损伤，导致软骨退变^[10]。最近的临床组织分析研究^[11]显示，GPX4在OA软骨中的表达显著降低，这表明抑制铁死亡有助于OA的进展。

GSH可被GPX4用于减少脂质过氧化物，从而抑制铁死亡。半胱氨酸/谷氨酸膜逆向转运体SLC7A11和GPX4是公认的铁死亡生物标志物。p53是作用于SLC7A11的众多上游调控基因之一。p53/SLC7A11/GPX4已被证明是铁死亡的经典信号通路^[12]。考虑到CUR直接抑制OA软骨细胞中的铁死亡后导致GSH增加，本研究推测p53/SLC7A11/GPX4信号通路可能参与其中。Western blotting结果验证了该假设。在IL-1β诱导的软骨细胞中，CUR和DFO均能独立地逆转SLC7A11和GPX4的抑制作用，减弱p53的诱导。此外，本研究还发现，CUR和DFO明显减轻了OA大鼠模型中IL-1β诱导的COL2A和SLC7A11抑制。与DFO相比，CUR在改善OA软骨损伤方面表现出更强的作用，这种差异可能因为二者对铁死亡的抑制形式不同。

综上所述，本研究证实了CUR在OA中的抗炎和抗软骨降解特性，进一步证明了CUR通过p53/SLC7A11/GPX4信号通路调控铁死亡。本研究有助于了解CUR的治疗效果，为今后OA的治疗提供了新的思路。