变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一种常见的异质性慢性疾病，是由室外和室内环境中的吸入性过敏原引起的，可引起一系列并发症，如哮喘、鼻窦炎等，严重影响患者生活质量^[1]。AR的基础和临床研究近年来取得显著进展，药物治疗（包括皮质类固醇、抗组胺药、膜稳定剂等）仍是核心手段，可有效控制严重症状，但易复发，且长期使用可能引发心悸、头晕、骨质疏松等不良反应^[2]。因此，寻找新型、有效且安全的治疗AR的药物具有重要意义。

中医将AR归为“鼻鼽”范畴，肺气虚寒是其主要证型之一，肺卫不固、风寒之邪侵袭是其病机，应以温肺益气、散寒通窍为主要治疗原则^[3]。益气温肺通窍方是一种中药方剂，由黄芪、白术、防风、桂枝、辛夷等中药组成，具有温肺散寒、益气固表、活血通窍的功效。研究^[4]显示，温肺益气方可改善肺气虚寒型AR患者的鼻过敏症状，促进鼻功能恢复，提高患者的生活质量。然而，益气温肺通窍方对肺气虚寒型AR的治疗作用及其机制尚不清楚。Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）/信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路是炎性细胞因子主要传导途径，细胞因子与受体结合后激活JAK1，磷酸化STAT3使其入核，调控炎症基因转录，促进鼻黏膜炎症反应和免疫应答^[5]。研究^[6]报道，益气温肺通窍方中的多味中药及其活性成分（如黄芪多糖）可抑制JAK1/STAT3信号通路活化。因此，本研究基于JAK1/STAT3信号通路，探讨益气温肺通窍方对肺气虚寒型AR大鼠炎症反应的影响。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

益气温肺通窍方（黄芪10 g、白术10 g、防风6 g、桂枝6 g、辛夷10 g、陈皮10 g、蜜麻黄5 g、五味子10 g、川芎10 g、蝉蜕10 g、炙甘草3 g），由河南省中医院制剂室提供，经浸泡、煎煮、浓缩后，制备浓度为2 g/mL的药液，4 ℃保存备用；JAK1/STAT3信号通路激活剂RO8191（纯度98.82%），购自美国MCE公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、氢氧化铝，购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠白细胞介素（interleukin，IL）-4、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、OVA特异性免疫球蛋白E（ovalbumin-specific immunoglobulin E，OVA-sIgE）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、GAPDH，购自美国ThermoFisher Scientific公司。Epoch全波长酶标仪，购自美国BioTek公司；BX51光学显微镜，购自日本Olympus公司。

1.2 实验动物和分组

72只SD大鼠，雄性，SPF级，6~7周龄，体质量（180~200）g，购自杭州启真实验动物科技有限公司，许可证号SCXK（浙）2022-0005。大鼠在干净的笼子中饲养，室温（23±3）℃，接受正常的光暗循环，从上午8：00开始12 h光暗循环，允许自由进食和饮水。所有实验均经河南省中医院伦理委员会审核批准。

建立肺气虚寒型AR大鼠模型^[7]。将肺气虚寒型AR大鼠分为模型组、氯雷他定组、低剂量中药组、高剂量中药组、高剂量中药+RO8191组，每组12只；另取12只正常大鼠作为对照组。氯雷他定组大鼠给予2 mg/kg氯雷他定灌胃^[8]，1次/d，持续14 d；低、高剂量中药组大鼠分别给予8、16 g/kg益气温肺通窍方药液灌胃（剂量按照人与大鼠的体表面积换算），1次/d，持续14 d；高剂量中药+RO8191组大鼠给予16 g/kg益气温肺通窍方药液和21 mg/kg RO8191^[9]灌胃，1次/d，持续14 d；对照组和模型组大鼠给予生理盐水灌胃，1次/d，持续14 d。

1.3 构建肺气虚寒型AR模型

采用OVA+氢氧化铝的方法，构建肺气虚寒型AR大鼠模型。第1~13天（基础致敏）：大鼠腹腔注射200 μL致敏液（0.3 mg OVA+30 mg氢氧化铝溶于1 mL生理盐水），1次/2 d，共7次。第14~20天（强化致敏）：大鼠双侧鼻腔滴入5% OVA，每侧鼻腔50 μL/次，1次/d，共7次；大鼠出现挠鼻、流清涕、打喷嚏等症状，且AR行为学评分>5分，表示AR模型制备成功。第21~35天（维持致敏）：大鼠双侧鼻腔持续滴入5% OVA，每侧鼻腔50 μL/次，1次/2 d，直到实验结束。AR模型构建成功后（第20天开始），采用烟熏与寒冷刺激联合诱导建立肺气虚寒型模型。将大鼠置于自制的烟熏箱内，在箱内四周放置冰块，当温度降至0 ℃时，点燃置于艾灸盒（经塑料管与烟熏箱相通）内的艾条，使烟气经管道进入箱内，烟熏时间为30 min，寒冷刺激时间为1 h，1次/d，持续15 d。大鼠出现精神萎靡、活动减少，毛色不光泽、大便偏稀、明显聚集等症状，表示肺气虚寒型AR模型制备成功^[7]。

1.4 大鼠行为学观察

1.4.1 肺气虚寒证的行为学观察

观察指标包括精神状态、运动情况、毛色、呼吸、大便、体温^[7]。

1.4.2 AR的行为学观察

观察大鼠挠鼻、打喷嚏、流清涕等AR发作时的症状，记录末次给药30 min内AR症状评分。评分标准^[7]：（1）挠鼻：无挠鼻行为计为0分，轻擦鼻1~4次计为1分，挠鼻5~10次计为2分，挠鼻11次及以上计为3分；（2）打喷嚏：无打喷嚏行为计为0分，打喷嚏1~3次计为1分，打喷嚏4~10次计为2分，打喷嚏11次及以上计为3分；（3）流清涕：未流清涕计为0分，清涕流至前鼻孔计为1分，清涕流出前鼻孔计为2分，涕流满面计为3分。

1.5 ELISA检测大鼠血清IFN-γ、IL-4、TNF-α、OVA-sIgE水平

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，腹主动脉采血，离心，分离血清，ELISA检测血清IL-4、IFN-γ、TNF-α、OVA-sIgE水平。

1.6 检测鼻腔灌洗液中炎症细胞数量

每组随机选取6只大鼠，麻醉后仰卧位固定，用无菌注射器将1.5 mL生理盐水缓慢注入一侧鼻腔，从对侧鼻腔回收鼻腔灌洗液，重复3次。将鼻腔灌洗液3 000 r/min离心10 min，取沉淀物涂片，行常规瑞氏染色，计数白细胞和嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）。随机选取5个视野计数，计算EOS百分比，EOS（%）=EOS数量/白细胞数量×100。

1.7 HE染色检测鼻黏膜组织病理变化

将每组剩余6只大鼠处死，沿鼻中线剪开鼻腔，小心分离鼻中隔并分离鼻黏膜，将部分鼻黏膜组织液氮速冻后保存在-80 ℃冰箱中，剩余鼻黏膜组织固定在4%多聚甲醛中，石蜡包埋，切片（4 μm），HE染色后光学显微镜下观察各组大鼠鼻黏膜病理变化。

1.8 Western blotting检测鼻黏膜组织中JAK1/STAT3信号通路相关蛋白表达

从大鼠鼻黏膜组织中提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，取总蛋白样品进行电泳，并转至PVDF膜上，以JAK1（1∶1 000）、p-JAK1（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）为一抗，将膜与一抗在4 ℃孵育过夜。随后，将膜与二抗（1∶2 000）室温再孵育1 h。根据ECL试剂盒说明书对蛋白条带进行显色，并采用Quantity One软件分析灰度值。

1.9 统计学分析

采用GrapahPad Prism 8.0软件进行统计分析。结果均以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠行为学的比较

对照组大鼠精神状态良好，活动较多，毛发有光泽，呼吸音、大便均正常。与对照组相比，模型组大鼠精神萎靡，活动减少，毛发枯黄、无光泽，有打喷嚏、流涕、挠鼻表现，大便偏稀，喜蜷缩抱团，AR症状评分升高（P < 0.05）。与模型组相比，氯雷他定组和低、高剂量中药组大鼠精神状态明显改善，活动增加，毛发未见枯黄，打喷嚏、流涕、挠鼻表现均减少，偶有稀便，少数抱团，AR症状评分降低（P < 0.05）。与高剂量中药组相比，高剂量中药+RO8191组大鼠精神萎靡，活动减少，毛发枯黄且失去光泽，打喷嚏、流涕、挠鼻表现加重，明显扎堆，AR症状评分升高（P < 0.05）。见表 1。

2.2 各组大鼠血清IFN-γ、IL-4、TNF-α、OVA-sIgE水平的比较

模型组IFN-γ水平低于对照组，IL-4、TNF-α、OVA-sIgE水平高于对照组（P < 0.05）。氯雷他定组和低、高剂量中药组IFN-γ水平高于模型组，IL-4、TNF-α、OVA-sIgE水平低于模型组（P < 0.05）。高剂量中药+RO8191组IFN-γ水平低于高剂量中药组，IL-4、TNF-α、OVA-sIgE水平高于高剂量中药组（P < 0.05）。见表 2。

2.3 各组大鼠鼻腔灌洗液中EOS百分比的比较

对照组、模型组、氯雷他定组、低剂量中药组、高剂量中药组和高剂量中药+RO8191组大鼠鼻腔灌洗液中EOS百分比分别为（5.80±0.81）%、（29.46±1.53）%、（12.52±1.17）%、（21.69±1.40）%、（13.37±1.25）%、（24.94±1.48）%。模型组EOS百分比高于对照组（P < 0.05）。氯雷他定组和低、高剂量中药组EOS百分低于模型组（P < 0.05）。高剂量中药+RO8191组EOS百分比高于高剂量中药组（P < 0.05）。

2.4 各组大鼠鼻黏膜组织病理变化

对照组大鼠鼻黏膜组织结构完整，上皮细胞紧密排列，未见明显血管扩张和炎症细胞浸润。与对照组相比，模型组大鼠黏膜上皮细胞脱落、溃烂，血管扩张明显，黏膜层和黏膜下层分界不清，且有大量炎症细胞浸润。与模型组相比，氯雷他定组和低、高剂量中药组大鼠鼻黏膜上皮细胞结构较完整，无明显血管扩张，炎症细胞浸润减少。与高剂量中药组相比，高剂量中药+RO8191组大鼠鼻黏膜损伤加重，黏膜上皮细胞脱落，血管明显扩张，黏膜层和黏膜下层分界模糊，炎症细胞浸润增加。见图 1。

2.5 各组大鼠鼻黏膜组织中JAK1/STAT3信号通路相关蛋白表达水平的比较

与对照组相比，模型组大鼠鼻黏膜组织中p-JAK1/ JAK1、p-STAT3/STAT3水平升高（P < 0.05）。与模型组相比，氯雷他定组和低、高剂量中药组p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3水平降低（P < 0.05）。与高剂量中药组相比，高剂量中药+RO8191组p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3水平升高（P < 0.05）。见图 2、表 3。

3 讨论

益气温肺通窍方由黄芪、白术、辛夷等11味中药组成，具温肺散寒、益气通窍的功效。现代药理学研究^[10]表明，辛夷可调节Th1/Th2免疫平衡（降低IL-4、IL-5，升高IL-2、IFN-γ），减轻AR炎症反应。本研究中，益气温肺通窍方可改善肺气虚寒型AR大鼠的肺气虚寒证候，减轻打喷嚏、挠鼻和流涕等鼻部症状，HE染色表明，该方可明显减轻大鼠鼻黏膜炎症浸润，提示对肺气虚寒型AR具良好疗效。

AR由特定过敏原经IgE介导引发，Th1/Th2细胞因子失衡是其主要病理机制，表现为Th2免疫反应增强（分泌IL-4、IL-5等，促B细胞分化及IgE产生，刺激EOS增殖活化）和Th1细胞减少（分泌IFN-γ，抑制IgE合成及EOS浸润）。鼻黏膜中EOS积聚是AR的重要特征，TNF-α作为主要促炎介质，其抗剂可通过降低Th2细胞因子（IL-4）、总IgE和OVA-sIgE水平及EOS浸润，减少AR小鼠过敏反应^[11-12]。本研究表明，肺气虚寒型AR大鼠存在Th1/Th2细胞因子失衡（血清IFN-γ降低，IL-4、TNF-α、OVA-sIgE升高，鼻腔灌洗液EOS百分比升高），而益气温肺通窍方可升高IFN-γ水平，降低IL-4、TNF-α、OVA-sIgE及EOS水平，提示其可调节Th1/Th2细胞因子平衡，减轻肺气虚寒型AR大鼠炎症反应。

JAK1/STAT3通路异常激活参与多种疾病进展，在OVA诱导的AR小鼠中，激活JAK1/STAT3通路可导致炎性细胞因子高表达，加重Th2免疫反应及鼻过敏症状、EOS积聚^[13]。此外，TNF-α、IL-6等炎性细胞因子可通过激活JAK1/STAT3信号通路诱导炎症，促进肺气虚形成^[14]。本研究结果表明，在肺气虚寒型AR大鼠的鼻黏膜组织中，JAK1/STAT3信号通路被显著激活，具体表现为JAK1和STAT3磷酸化水平升高。益气温肺通窍方可有效抑制该通路的异常活化，显著降低JAK1和STAT3磷酸化水平。研究进一步发现，JAK1/STAT3通路激活剂RO8191能够削弱益气温肺通窍方的抗炎作用，提示该方剂可能通过抑制JAK1/STAT3信号通路减轻肺气虚寒型AR炎症反应。

综上所述，益气温肺通窍方可能通过抑制JAK1/ STAT3信号通路，调节Th1/Th2细胞因子平衡，减轻肺气虚寒型AR大鼠炎症反应，为该病的治疗提供了理论依据。但鉴于AR发病机制和中药成分的复杂性，该方的主要活性成分及其他作用途径仍有待深入研究。