2025, Vol. 54文章信息
- 唐跃虹, 罗玉宁, 许丽彬, 胡小英, 邱春萍
- TANG Yuehong, LUO Yuning, XU Libin, HU Xiaoying, QIU Chunping
- 根皮素通过调节Rac1/Akt/NF-κB信号通路对卵巢癌细胞增殖、凋亡和致瘤性的影响
- Effects of phloretin on the proliferation, apoptosis, and tumorigenicity of ovarian cancer cells by regulating Rac1/Akt/NF-κB signaling pathway
- 中国医科大学学报, 2025, 54(9): 821-825,831
- Journal of China Medical University, 2025, 54(9): 821-825,831
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文章历史
- 收稿日期：2024-10-21
- 网络出版时间：2025-09-16 07:10:10
引用本文 |
卵巢癌是最常见的妇科癌症之一，发病率高，患者预后差，严重影响女性健康[1]。由于卵巢癌早期无特异性症状，且特异性标志物、诊断方法有限，大多数卵巢癌患者在疾病晚期才被诊断，化疗耐药导致致死率和复发率较高，因此迫切需要寻找新的药物治疗卵巢癌[2-3]。根皮素是一种二氢查尔酮，属于次要类黄酮类化合物，研究[4]表明，在胃癌、结肠癌等中，根皮素通过抗增殖、促凋亡发挥重要的抗癌活性。但关于其在卵巢癌中作用的研究甚少。Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）信号在人类癌症中经常被激活，抑制Rac1可以通过抑制焦亡抑制卵巢癌发展[5]。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）作为Rac1信号转导的重要下游效应子，主动调节核因子κB（nuclear factor-κB，NF‐κB），在促进肿瘤（包括卵巢癌）的发生和进展中起至关重要的作用[6]。研究[7]表明，根皮素衍生物通过抑制pAkt/NF-κB可阻止脑缺血再灌注损伤诱导的神经元丢失、神经炎症和氧化应激，但根皮素能否通过Rac1/Akt/NF-κB信号通路影响卵巢癌细胞的生物学发展和致瘤性尚未见研究报道。因此，本研究通过体内外实验，探讨根皮素对卵巢癌细胞恶性发展的作用及其潜在机制。
1 材料与方法 1.1 主要材料和仪器卵巢癌细胞系SKOV3和人正常卵巢上皮细胞系IOSE-80，购自中国科学院典型培养保藏委员会细胞库。用RPMI-1640培养基培养细胞，置于恒定湿度、37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，每2~3 d传代培养1次，用10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素维持培养基。
CCK-8试剂，购自日本同仁化学研究所；根皮素（质量分数99.99%），购自美国Sigma公司；通路激活剂佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA），购自美国Cayman Chemical公司；细胞凋亡试剂盒，购自上海碧云天生物技术股份有限公司；裂解缓冲液，购自北京博奥森生物技术有限公司；p-NF-κB p65、NF-κB p65、Rac1、p-Akt/Akt抗体，购自英国abcam公司。
BioTek ELx800酶标仪，购自美国BioTek公司；BB15-51023121培养箱，购自德国Heraeus Holding GmbH公司；ACSC Ⅱ流式细胞仪，购自美国BD公司。
1.2 细胞实验 1.2.1 细胞分组和处理将生长良好的SKOV3细胞和IOSE-80细胞，分别分为对照组、根皮素低剂量组、根皮素中剂量组、根皮素高剂量组、PMA组、根皮素高剂量+PMA组。对照组：细胞用正常培养基培养24 h；根皮素低剂量组、根皮素中剂量组、根皮素高剂量组：根据预实验和文献[8]，细胞用50、100、200 μmol/L的根皮素刺激24 h；PMA组，细胞用50 nmol/L PMA刺激24 h[9]；根皮素高剂量+PMA组：细胞用200 μmol/L根皮素和50 nmol/L PMA共同刺激24 h。
1.2.2 细胞活力分析检测根皮素对SKOV3细胞和IOSE-80细胞活力影响。以1×104/孔的密度将细胞接种到96孔板，将分组处理后的细胞孵育24 h，37 ℃下加入0.5 mg/mL CCK-8试剂孵育，在培养箱中孵育2 h后，用BioTek ELx800酶标仪测量450 nm处的吸光度，分析细胞活力变化。
1.2.3 SKOV3细胞形态分析将细胞以1×106/孔的密度接种到6孔板，分组处理24 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态学。
1.2.4 SKOV3细胞克隆形成实验细胞以5×102/孔的密度接种到35 mm板中，分组处理后在37 ℃下培养2周，洗涤细胞后，固定液固定细胞、结晶紫染色，用水轻轻洗涤孔板，在室温下风干，在显微镜下进行成像并计数集落数。
1.2.5 SKOV3细胞凋亡变化收集分组处理后的SKOV3细胞，将胰蛋白酶消化的细胞与500 μL结合缓冲液一起孵育，在进行流式细胞术前，用碘化丙啶和膜联蛋白V-FITC避光染色孵育重悬后的细胞，分析细胞凋亡变化。
1.2.6 SKOV3细胞中Rac1/Akt/NF-κB信号通路相关蛋白表达将SKOV3细胞接种到6孔板，将细胞裂解物收集在1.5 mL试管中，离心去除多余细胞碎片，收集上清液检测总蛋白浓度。分离每个样品中的10 μg蛋白质，在100 V下转移到膜上，脱脂牛奶封闭膜，与NF-κB p65、Rac1、p-Akt、Akt、p-NF-κB p65抗体和二抗孵育，随后进行蛋白质条带显影、成像。使用ImageJ软件进行定量分析。
1.3 裸鼠移植瘤实验24只25~30 g雌性BALB/C裸鼠，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。将SKOV3细胞制备成单细胞悬液（3×107/mL），皮下接种0.2 mL细胞悬液，待肿瘤体积达到1 cm3时，将裸鼠分为空白对照组、根皮素低剂量组、根皮素高剂量组，每组8只。根皮素低、高剂量组小鼠分别腹腔注射25和50 mg/kg的根皮素[10]，1次/d，连续6周。空白对照组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。安乐处死所有小鼠，分离肿瘤组织，测量肿瘤重量。在室温下加入3%过氧化氢孵育，用柠檬酸抗原修复缓冲液进行抗原修复，与抗Rac1、Akt一抗及二抗孵育，滴二氨基联苯胺显色液，苏木素复染，切片脱水封闭，显微镜下拍照，分析光密度值。
1.4 统计学分析采用SPSS 26.0软件分析数据。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较行SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 根皮素对SKOV3和IOSE-80细胞活力的影响各组IOSE-80细胞活力均无明显变化（P > 0.05）。SKOV3细胞中，根皮素低、中、高剂量组细胞存活率较对照组降低，且呈剂量依赖性；PMA组细胞存活率较对照组升高（P < 0.05）；根皮素高剂量+PMA组细胞存活率较根皮素高剂量组升高（P < 0.05），较PMA组降低（P < 0.05）。见表 1。
| Group | n | Survival rate of IOSE-80 cells（%） | Survival rate of SKOV cells（%） |
| Control | 6 | 90.75±9.11 | 90.06±9.07 |
| Low-doese phloretin | 6 | 91.03±8.96 | 71.03±7.151） |
| Medium-dose phloretin | 6 | 90.42±9.08 | 50.42±5.071），2） |
| High-dose phloretin | 6 | 90.37±9.07 | 31.11±3.191），2），3） |
| PMA | 6 | 90.88±9.06 | 137.06±13.881） |
| High-dose phloretin+PMA group | 6 | 90.65±9.14 | 70.94±7.114），5） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. low-dose phloretin group；3）P < 0.05 vs. medium-dose phloretin group；4）P < 0.05 vs. high-dose phloretin group；5）P < 0.05 vs. PMA group. | |||
2.2 根皮素对SKOV3细胞形态变化的影响
根皮素低、中、高剂量组较对照组细胞皱缩且数量逐渐减少，PMA组较对照组细胞数量明显增加；根皮素高剂量+PMA组细胞数量较根皮素高剂量组增加，贴壁性变强，但较PMA组数量明显减少。见图 1。
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| A, control group; B, low-dose phloretin group; C, medium-dose phloretin group; D, high-dose phloretin group; E, PMA group; F, high-dose phloretin+PMA group. 图 1 各组SKOV3细胞形态的变化×200 Fig.1 Morphological changes of SKOV3 cells in each group ×200 |
2.3 根皮素对SKOV3细胞集落数的影响
根皮素低、中、高剂量组细胞集落数较对照组减少，呈剂量依赖性，PMA组细胞集落数较对照组增加（P < 0.05）；根皮素高剂量+PMA组细胞集落数较根皮素高剂量组增加（P < 0.05），较PMA组减少（P < 0.05）。见图 2、表 2。
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| A, control group; B, low-dose phloretin group; C, medium-dose phloretin group; D, high-dose phloretin group; E, PMA group; F, high-dose phloretin+PMA group. 图 2 各组SKOV3细胞集落数 Fig.2 Colony numbers of SKOV3 cells in each group |
| Group | n | Colony count | Apoptosis rate（%） | p-NF-κB p65/NF-κB p65 | p-Akt/Akt | Rac1/β-actin |
| Control | 6 | 111.42±11.24 | 9.53±0.97 | 0.68±0.07 | 0.58±0.06 | 1.21±0.13 |
| Low-doese phloretin | 6 | 80.05±8.051） | 15.34±1.561） | 0.41±0.051） | 0.33±0.041） | 0.77±0.081） |
| Medium-dose phloretin | 6 | 61.42±6.221），2） | 20.13±2.091），2） | 0.28±0.031），2） | 0.21±0.031），2） | 0.55±0.061），2） |
| High-dose phloretin | 6 | 42.07±4.221），2），3） | 32.16±3.251），2），3） | 0.18±0.021），2），3） | 0.13±0.021），2），3） | 0.24±0.031），2），3） |
| PMA | 6 | 148.24±14.911） | 5.18±0.531） | 0.85±0.081） | 0.79±0.081） | 1.58±0.161） |
| High-dose phloretin+PMA group | 6 | 79.88±8.054），5） | 15.22±1.554），5） | 0.38±0.044），5） | 0.37±0.044），5） | 0.72±0.084），5） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. low-dose phloretin group；3）P < 0.05 vs. medium-dose phloretin group；4）P < 0.05 vs. high-dose phloretin group；5）P < 0.05 vs. PMA group. | ||||||
2.4 根皮素对SKOV3细胞凋亡的影响
根皮素低、中、高剂量组细胞凋亡率较对照组增加，呈剂量依赖性，PMA组细胞凋亡率较对照组降低（P < 0.05）；根皮素高剂量+PMA组细胞凋亡率较根皮素高剂量组降低（P < 0.05），较PMA组增加（P < 0.05）。见表 2。
2.5 根皮素对SKOV3细胞通路相关蛋白表达的影响根皮素低、中、高剂量组p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-Akt/Akt、Rac1表达水平较对照组降低，呈剂量依赖性，PMA组较对照组升高（P < 0.05）；根皮素高剂量+PMA组p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-Akt/Akt、Rac1表达水平较根皮素高剂量组升高（P < 0.05），较PMA组降低（P < 0.05）。见表 2、图 3。
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| 1, control group; 2, low-dose phloretin group; 3, medium-dose phloretin group; 4, high-dose phloretin group; 5, PMA group; 6, high-dose phloretin+PMA group. 图 3 各组SKOV3细胞中NF-κB p65、Rac1、p-Akt、Akt、p-NF-κB p65蛋白表达 Fig.3 Expressions of NF-κB p65, Rac1, p-Akt, Akt, and p-NF-κB p65 proteins in SKOV3 cells in each group |
2.6 根皮素对裸鼠肿瘤重量的影响
根皮素低、高剂量组裸鼠肿瘤重量明显低于空白对照组（P < 0.05）。见图 4、表 3。
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| A, blank control group; B, low-dose phloretin group; C, high-dose phloretin group. 图 4 3组裸鼠移植肿瘤 Fig.4 Transplanted tumors in nude mice in the three groups |
| Group | n | Tumor weight（g） | Rac1 expression | Akt expression |
| Blank control | 8 | 0.73±0.09 | 0.68±0.07 | 0.77±0.08 |
| Low-dose phloretin | 8 | 0.54±0.061） | 0.44±0.051） | 0.52±0.061） |
| High-dose phloretin | 8 | 0.33±0.042） | 0.27±0.032） | 0.31±0.042） |
| 1）P < 0.05 vs. blank control group；2）P < 0.05 vs. low-dose phloretin group. | ||||
2.7 根皮素对裸鼠肿瘤组织中Rac1、Akt表达的影响
根皮素低、高剂量组裸鼠肿瘤组织中Rac1、Akt表达水平较空白对照组明显降低（P < 0.05），见表 3、图 5。
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| 图 5 3组裸鼠肿瘤组织中Rac1和Akt表达×400 Fig.5 Expressions of Rac1 and Akt in the tumor tissues of nude mice in the three groups ×400 |
3 讨论
研究[11]表明，天然化合物类黄酮是潜在的抗癌候选药物。根皮素作为一种膳食类黄酮，具有多种生物活性，包括抗氧化活性、预防心血管疾病、抗炎作用以及抗癌活性。本研究结果显示，根皮素对正常卵巢上皮细胞无毒性，却能特异性杀伤卵巢癌细胞，提示其可能成为低毒高效的抗癌候选药物，这一结果为卵巢癌的天然药物治疗提供了新的实验依据。根皮素的选择性作用可能与其靶向癌细胞信号通路异常有关。如在结直肠癌细胞中，根皮素可抑制降低结肠中Akt表达，诱导癌细胞凋亡，抑制其增殖[12]。但其在卵巢癌中的作用鲜有研究报道。本研究结果显示，不同浓度的根皮素干预SKOV3细胞后，可明显改变细胞形态，使细胞数量减少并发生皱缩，同时细胞集落数和活力也被明显抑制，细胞发生明显凋亡，并呈剂量依赖性。提示在一定剂量范围内，根皮素可以抑制SKOV3细胞恶性行为的发展。本研究体内实验发现，根皮素可抑制异种移植裸鼠肿瘤生长，进一步表明根皮素可在卵巢癌中发挥抗癌作用。
Rho家族GTP酶是调节癌症相关细胞功能的重要因子，包括基因转录的协调变化、肌动蛋白细胞骨架动力学，进而驱动细胞黏附、迁移、增殖等，且已被证明在许多人类癌症中发生突变和过表达。Rho A为Rho家族成员之一，在卵巢癌患者中Rac1过表达，其表达水平高预示卵巢癌患者生存率降低，提示Rac1与卵巢癌发展密切相关[13]。Akt作为Rac1信号转导的重要下游效应子，在细胞过程（如增殖、存活和凋亡）中起重要作用。Akt的异常激活已被证明与包括人类卵巢癌在内的各种癌症的进展有关。Akt抑制剂已在前列腺癌治疗试验中被开发，Akt为癌症治疗有效且有前途的分子靶点[14]。本研究通过体内外实验表明，根皮素干预后，Akt、Rac1表达水平明显降低，诱导SKOV3细胞凋亡，抑制细胞增殖和肿瘤生长，表明根皮素可能通过下调Akt、Rac1表达发挥抗卵巢癌的作用。研究[6]表明，NF-κB表达受Akt调控，下调Akt/NF-κB通路可抑制卵巢癌细胞迁移、侵袭、增殖，与本研究结果一致，提示根皮素可能通过抑制Rac1/Akt/NF-κB信号通路阻止卵巢癌发展。本研究结果显示，通路激活剂PMA逆转了根皮素对SKOV3细胞恶性发展的抑制作用，表明根皮素抑制SKOV3细胞恶性发展和肿瘤生长可能与抑制Rac1/Akt/NF-κB信号通路有关。
综上所述，根皮素通过抑制Rac1/Akt/NF-κB信号通路抑制SKOV3细胞恶性发展和肿瘤生长，但缺乏相关多细胞实验和动物实验进行验证，后续研究将针对不足之处进行补充实验，为根皮素用于卵巢癌治疗提供依据。
| [1] |
王雪梅, 贺鸣, 张婷婷, 等. 扶正祛邪方抑制表观遗传调控蛋白EZH2对卵巢癌细胞的影响及其机制[J]. 中国医科大学学报, 2024, 53(1): 1-7. DOI:10.12007/j.issn.0258-4646.2024.01.001 |
| [2] |
邱辉, 周佳任. 长链非编码RNA MALAT1靶向miR-218对卵巢癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响及其作用机制[J]. 中国医科大学学报, 2023, 52(5): 447-452. DOI:10.12007/j.issn.0258‐4646.2023.05.011 |
| [3] |
CHOI MS, KIM JH, LEE CY, et al. Gentian violet inhibits cell proliferation through induction of apoptosis in ovarian cancer cells[J]. Biomedicines, 2023, 11(6): 1657. DOI:10.3390/biomedicines11061657 |
| [4] |
TULI HS, RATH P, CHAUHAN A, et al. Phloretin, as a potent anticancer compound: from chemistry to cellular interactions[J]. Molecules, 2022, 27(24): 8819. DOI:10.3390/molecules27248819 |
| [5] |
WU J, WU Y, ZHAO T, et al. Targeting RAC1 reactivates pyroptosis to reverse paclitaxel resistance in ovarian cancer by suppressing P21-activated kinase 4[J]. MedComm, 2024, 5(9): e719. DOI:10.1002/mco2.719 |
| [6] |
LIU YL, CAO Y, KAI HL, et al. Polyphyllin E inhibits proliferation, migration and invasion of ovarian cancer cells by down-regulating the AKT/NF-κB pathway[J]. Biol Pharm Bull, 2022, 45(5): 561-568. DOI:10.1248/bpb.b21-00691 |
| [7] |
LIU DF, WU WD, WANG TT, et al. Lithocarpus polystachyus Rehd. ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury through inhibiting PI3K/AKT/NF-κB pathway and regulating NLRP3-mediated pyroptosis[J]. Front Pharmacol, 2024, 15: 1365642. DOI:10.3389/fphar.2024.1365642 |
| [8] |
单良, 肖建英. 根皮素对人卵巢癌细胞增殖的影响及虚拟筛选研究[J]. 中药材, 2018, 41(6): 1479-1485. DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2018.06.048 |
| [9] |
胡维, 熊丹, 黄娟. 补肾活血汤抑制糖尿病肾病引起的足细胞损伤及EMT发生机制研究[J]. 天津中医药大学学报, 2019, 38(3): 262-266. DOI:10.11656/j.issn.1673-9043.2019.03.15 |
| [10] |
康丹, 尹莹莹, 王方方, 等. 根皮素诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡并抑制其裸鼠移植瘤的生长[J]. 肿瘤, 2017, 37(6): 545-555. DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2017.11.143 |
| [11] |
JANG SY, KIM J, HONG E, et al. Phloretin inhibits the proliferation of breast cancer cells through the down-regulation of estrogen receptor α[J]. Anticancer Res, 2024, 44(3): 1109-1120. DOI:10.21873/anticanres.16906 |
| [12] |
ABDEL-WAHAB EA, Al-QAIM ZH, FARIS AL-KARKHI ATH, et al. Phloretin-nanospanlastics for targeting the Akt/PI3K signaling pathways in dimethylhydrazine-induced colon cancer in mice[J]. Int J Pharm X, 2024, 9: 100311. DOI:10.1016/j.ijpx.2024.100311 |
| [13] |
RIVERA M, TOLEDO-JACOBO L, ROMERO E, et al. Agent-based modeling predicts RAC1 is critical for ovarian cancer metastasis[J]. Mol Biol Cell, 2022, 33(14): ar138. DOI:10.1091/mbc.E21-11-0540 |
| [14] |
SWEENEY C, BRACARDA S, STERNBERG CN, et al. Ipatasertib plus abiraterone and prednisolone in metastatic castration-resistant prostate cancer (IPATential150): a multicentre, randomised, double- blind, phase 3 trial[J]. Lancet, 2021, 398(10295): 131-142. DOI:10.1016/S0140-6736(21)00580-8 |