2025, Vol. 54文章信息
- 杨英阁, 张晋雷, 孙岩, 陈升, 梁正
- YANG Yingge, ZHANG Jinlei, SUN Yan, CHEN Sheng, LIANG Zheng
- miR-202-5p通过靶向抑制ROCK1表达减轻急性呼吸窘迫综合征新生大鼠肺损伤
- miR-202-5p alleviates lung injury in neonatal rats with acute respiratory distress syndrome by targeting the inhibition of ROCK1 expression
- 中国医科大学学报, 2025, 54(9): 814-820
- Journal of China Medical University, 2025, 54(9): 814-820
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文章历史
- 收稿日期：2025-04-01
- 网络出版时间：2025-09-16 09:16:20
引用本文 |
2. 河南省人民医院新生儿重症监护室，郑州 450003;
3. 中国医科大学实验动物部，沈阳 110122;
4. 内江市第二人民医院麻醉科，四川 内江 641100
2. Neonatal Intensive Care Unit, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003, China;
3. Department of Laboratory Animal Science, China Medical University, Shenyang 110122, China;
4. Department of Anesthesiology, The Second People's Hospital of Neijiang, Neijiang 641100, China
急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由原发性或继发性肺泡表面活性物质减少引起的呼吸系统疾病，进展迅速且死亡率高，严重威胁新生儿的生命。ARDS临床表现为气促、呼吸窘迫、低氧血症、双肺透光率下降甚至白肺[1]。在临床实践中，呼吸支持、肺表面活性物质替代治疗、体外膜肺氧合、营养支持和液体管理是新生儿ARDS的主要治疗方法[2]。然而，新生儿ARDS仍缺乏有效治疗方法。微RNA（microRNA，miRNA）作为一类基因调控分子，可通过影响靶基因的表达来调节炎症途径和免疫反应，在ARDS的发病机制中发挥重要作用[3]。LIANG等[4]研究发现miR-124-3p通过靶向抑制p65表达改善ARDS模型小鼠的炎症和肺损伤。HE等[5]研究发现miR-574-5p通过靶向抑制高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）表达抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路和NLRP3炎症小体激活，从而抑制ARDS小鼠肺泡白细胞浸润、间质水肿、蛋白渗出和炎症。1项生物信息学研究[6]发现miR-202-5p在ARDS大鼠肺组织中表达下调。目前，miR-202-5p对ARDS诱导的肺损伤的影响及其机制研究尚未见报道。本研究通过腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立新生大鼠ARDS模型，探讨过表达miR-202-5p对ARDS新生大鼠肺损伤的影响及其机制，旨在为ARDS治疗方法的开发提供新思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物和细胞SD孕鼠购自中国医科大学实验动物部，饲养于23~25 ℃，每日光照/黑暗各12 h的环境中。将新生SD大鼠饲养7 d，选取体重10~13 g的7日龄新生大鼠进行实验。本研究获得中国医科大学实验动物伦理委员会批准（审批号CMUKT2024175）。293T细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，用DMEM培养基（含10%胎牛血清和1%青链霉素）在37 ℃、5 %CO2条件下培养。
1.2 主要试剂和仪器miR-NC、miR-202-5p、过表达对照腺病毒（ov-NC）和过表达ROCK1腺病毒（ov-ROCK1）由苏州吉玛基因股份有限公司合成。HE染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Western blotting相关试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；Western blotting一抗以及二抗购自英国abcam公司；实时定量PCR相关试剂购自日本TaKaRa公司。酶标仪购自美国BioTek公司；凝胶扫描成像系统购自美国Bio-Rad公司；普通PCR仪和实时定量PCR仪购自美国ABI公司；光学显微镜购自日本OLYMPUS公司。
1.3 方法 1.3.1 动物分组及处理新生SD大鼠随机分为对照组、ARDS组、ARDS+miR-NC组、ARDS+miR-202-5p组、ARDS+miR-202-5p+ov-NC组和ARDS+miR-202-5p+ov-ROCK1组，每组10只。除对照组外，各组大鼠腹腔注射LPS（4 mg/kg）建立大鼠ARDS模型[7]。对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。ARDS+miR-NC组大鼠造模后尾静脉注射miR-NC（2 mg/kg），ARDS+miR-202-5p组、ARDS+miR-202-5p+ov-NC组和ARDS+miR-202-5p+ov-ROCK1组造模后尾静脉注射miR-202-5p（2 mg/kg），1次/4 h，连续干预12 h。ARDS+miR-202-5p+ov-NC组和ARDS+miR-202-5p+ov-ROCK1组分别于造模前3 d经尾静脉注射OV-NC、OV-ROCK1（6×108 PFU）。实验结束后大鼠腹腔注射过量2%戊巴比妥钠麻醉处死，打开胸腔并暴露心肺，分离左肺和右肺用于后续检测。
1.3.2 HE染色将分离的左肺组织经4%多聚甲醛固定后，常规方法制备石蜡切片。切片经脱蜡水化后依次用苏木素和伊红染色，脱水透明封片后光学显微镜观察并拍照。
1.3.3 肺组织病理损伤根据文献[8]方法对肺组织损伤程度进行评分。
1.3.4 肺组织水肿程度将取出的肺组织剪去残存支气管和结缔组织，分离右肺膈叶和副叶，蒸馏水清洗并用吸水纸吸干水分，称量湿重。将称量后的肺组织放入60 ℃恒温烘箱内，烘干24 h至恒质量，称量干重。计算湿重/干重比值来评估肺组织水肿程度。
1.3.5 实时定量PCR将收集的肺组织置于研钵中，液氮研磨处理。TRIzol法提取组织中总RNA，将RNA反转录为cDNA，检测miRNA的样本反转录时需加入逆转录引物。以cDNA为模板进行实时定量PCR，以U6或β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
1.3.6 Western blotting将收集的肺组织液氮磨碎后用RIPA裂解液裂解，离心收集蛋白。BCA法定量后配置蛋白样品。煮样变性后电泳分离蛋白，湿转法将其转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭后用ROCK1、Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）、NF-κB p65、p-NF-κB p65、核因子κB抑制蛋白α（inhibitor of nuclear factor-κBα，IκBα）、p-IκBα和β-actin抗体4 ℃孵育过夜。PBST洗膜3次。二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次。ECL法发光，分析电泳条带灰度值并计算相对表达量。
1.3.7 双萤光素酶报告基因实验ROCK1与miR-202-5p潜在结合位点采用TargetScan在线数据库（https://www.targetscan.org）预测。将ROCK1-WT或ROCK1-MUT与mimics NC或miR-202-5p mimics（由苏州吉玛基因股份有限公司合成）共转染293T细胞，培养24 h后收集并裂解，依次检测萤火虫和海肾萤光素酶活性。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析和Tukey法。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 ARDS大鼠肺组织miR-202-5p表达情况实时定量PCR检测结果显示，对照组、ARDS组、ARDS+miR-NC组和ARDS+miR-202-5p组大鼠肺组织中miR-202-5p相对表达水平分别为0.99±0.06、0.44±0.07、0.43±0.10、0.67±0.09。与对照组比较，ARDS组和ARDS+miR-NC组大鼠肺组织中miR-202-5p表达明显降低（P < 0.05）；与ARDS组和ARDS+miR-NC组比较，ARDS+miR-202-5p组大鼠肺组织中miR-202-5p表达明显升高（P < 0.05）。
2.2 过表达miR-202-5p对ARDS大鼠肺组织病理损伤的影响HE染色结果显示，对照组大鼠肺泡结构完整且腔内未见渗出物；ARDS组和ARDS+miR-NC组大鼠肺泡萎缩且完整性破坏，可见充血和大量红细胞浸润；ARDS+miR-202-5p组大鼠肺组织上述病理损伤有所改善。ARDS组和ARDS+miR-NC组大鼠肺组织病理损伤评分较对照组明显升高（P < 0.05）；与ARDS组和ARDS+miR-NC组比较，ARDS+miR-202-5p组大鼠肺组织病理损伤评分明显降低（P < 0.05）。见图 1。
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| A, HE staining (×200);B, lung tissue pathological injury score. * P < 0.05 vs. control group; # P < 0.05 vs. ARDS group; △ P < 0.05 vs. ARDS+miR-NC group. 图 1 各组大鼠肺组织病理损伤比较 Fig.1 Comparison of lung tissue pathological injury of rats in each group |
2.3 过表达miR-202-5p对ARDS大鼠肺组织水肿程度的影响
结果显示，对照组、ARDS组、ARDS+miR-NC组和ARDS+miR-202-5p组大鼠肺组织的湿重/干重比值分别为4.89±0.31、10.31±0.42、10.06±0.59、7.69± 0.50。ARDS组和ARDS+miR-NC组大鼠肺组织湿重/干重比值较对照组明显升高（P < 0.05）；与ARDS组和ARDS+miR-NC组比较，ARDS+miR-202-5p组大鼠肺组织湿重/干重比值明显降低（P < 0.05）。可见过表达miR-202-5p可减轻ARDS大鼠肺组织水肿程度。
2.4 过表达miR-202-5p对ARDS大鼠肺组织中ROCK1和TLR4/NF-κB信号通路的影响对照组、ARDS组、ARDS+miR-NC组和ARDS+miR-202-5p组大鼠肺组织中ROCK1 mRNA相对表达量分别为1.05±0.08、3.61±0.45、3.35±0.30、1.80±0.21。与对照组比较，ARDS组和ARDS+miR-NC组大鼠肺组织中ROCK1 mRNA和蛋白以及TLR4、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白表达水平明显升高（P < 0.05）；与ARDS组和ARDS+miR-NC组比较，ARDS+miR-202-5p组大鼠肺组织中ROCK1 mRNA和蛋白以及TLR4、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）。各组新生大鼠肺组织中NF-κBp65和IκBα蛋白表达水平比较无统计学差异（P>0.05）。见图 2。
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| * P < 0.05 vs. control group; # P < 0.05 vs. ARDS group; △ P < 0.05 vs. ARDS+miR-NC group. 图 2 各组大鼠肺组织中ROCK1和TLR4/NF-κB信号通路蛋白的表达 Fig.2 Expression of ROCK1 and TLR4/NF-κB signaling pathway related proteins in lung tissue of rats in each group |
2.5 miR-202-5p与ROCK1的靶向关系
双萤光素酶报告基因实验结果显示，与mimics NC组比较，转染ROCK1-WT的miR-202-5p mimics组293T细胞的相对萤光素酶活性明显降低（P < 0.05），而转染ROCK1-MUT的mimics NC组与miR-202-5p mimics组293T细胞的相对萤光素酶活性比较无统计学差异（P > 0.05），见图 3。可见，miR-202-5p可靶向结合ROCK1。
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| * P < 0.05 vs. mimics NC group. 图 3 miR-202-5p与ROCK1的靶向关系 Fig.3 The targeting relationship between miR-202-5p and ROCK1 |
2.6 过表达ROCK1对过表达miR-202-5p的ARDS大鼠肺损伤的影响
Western blotting检测结果显示，与ARDS+miR- 202-5p组和ARDS+miR-202-5p+ov-NC组相比，ARDS+ miR-202-5p+ov-ROCK1组大鼠肺组织中ROCK1、TLR4、p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达水平明显升高（P < 0.05）。见图 4A。
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| A, expression of ROCK1 and TLR4/NF-κB signaling pathway related proteins; B, pathological injury of lung tissue (×200);C, lung tissue pathological injury score. 1, ARDS+miR-202-5p group; 2, ARDS+miR-202-5p+ov-NC group; 3, ARDS+miR-202-5p+ov-ROCK1 group. * P < 0.05 vs. ARDS+miR-202-5p group; # P < 0.05 vs. ARDS+miR-202-5p+ov-NC group. 图 4 过表达ROCK1对过表达miR-202-5p的ARDS大鼠肺损伤的影响 Fig.4 Effects of ROCK1 overexpression on lung injury in ARDS rats with miR-202-5p overexpression |
HE染色结果显示，ARDS+miR-202-5p+ov-ROCK1组大鼠肺组织病理损伤较ARDS+miR-202-5p组和ARDS+miR-202-5p+ov-NC组加重，见图 4B。与ARDS+miR-202-5p组和ARDS+miR-202-5p+ov-NC组相比，ARDS+miR-202-5p+ov-ROCK1组大鼠肺组织病理损伤评分明显升高（P < 0.05）。见图 4C。
3 讨论越来越多的证据表明，miR-202-5p在多种疾病发展中发挥作用。LI等[9]研究发现miR-202-5p上调可通过靶向抑制真核细胞翻译起始因子4E表达减轻氧糖剥夺/复氧诱导的神经元损伤。ZHAO等[10]研究发现过表达miR-202-5p通过靶向抑制瞬时受体电位香草样蛋白2表达改善心肌缺血再灌注损伤。此外，最近研究[11]发现miR-202-5p上调还能通过靶向抑制胞苷一磷酸激酶2表达抑制细胞焦亡，从而减轻肺缺血再灌注损伤。基于生物信息学分析的结果显示，miR-202-5p在ARDS大鼠肺组织中表达下调[6]。本研究结果显示，miR-202-5p在ARDS新生大鼠肺组织中表达下调，与上述生物信息学分析结果一致。此外，本研究还发现过表达miR-202-5p改善ARDS新生大鼠肺组织病理损伤，降低肺组织病理损伤评分和肺组织湿重/干重比值。这些结果表明过表达miR-202-5p可改善新生大鼠ARDS诱导的肺损伤。
ROCK1是RhoA的下游效应器，在激活单核细胞促炎反应中发挥分子开关作用，且参与高血压、动脉硬化、阿尔茨海默病和糖尿病等代谢相关疾病的发病[12-13]。多项研究发现miRNA可通过靶向抑制ROCK1表达改善LPS诱导的肺损伤。miR-144通过靶向抑制ROCK1表达改善LPS诱导的肺内皮细胞通透性增高[14]。miR-539-5p通过靶向抑制ROCK1表达改善LPS诱导的小鼠肺微血管内皮细胞的凋亡和炎症[15]。此外，还有研究[16]发现miR-495通过靶向抑制ROCK1表达抑制LPS诱导的WI-38细胞炎症损伤和凋亡。本研究发现miR-202-5p与ROCK1 mRNA的3’UTR靶向结合；ROCK1在ARDS新生大鼠肺组织中表达上调，且过表达miR-202-5p降低ARDS新生大鼠肺组织中ROCK1表达。此外，过表达ROCK1逆转了过表达miR-202-5p对ARDS新生大鼠肺损伤的保护作用。这些结果表明miR-202-5p可通过靶向抑制ROCK1表达改善新生大鼠ARDS诱导的肺损伤。
已有研究[17]表明，抑制ROCK1可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻肝纤维化。ROCK1作为Rho激酶家族成员之一，可能通过调节细胞骨架重排促进TLR4信号复合物的形成[18]。TLR4/NF-κB信号通路是免疫系统中应对感染、炎症和外部刺激的关键信号通路[19]。该信号通路涉及多种分子和细胞因子，包括TLR4受体、途径中的级联激活蛋白以及最终的NF-κB，对调节炎症和免疫反应至关重要[20]。TLR4激活后与位于细胞质中的MyD88形成复合物，激活下游IKK激酶并调节NF-κB激活，NF-κB从细胞质向细胞核转移并参与多种炎性细胞因子产生，从而启动一系列炎症反应[21]。研究[22]表明，黄连素通过抑制TLR4/NF-κB信号通路改善LPS诱导的ARDS肺损伤。本研究结果显示，过表达miR-202-5p抑制ARDS新生大鼠肺组织中TLR4、p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达，过表达ROCK1逆转过表达miR-202-5p对ARDS新生大鼠肺组织中TLR4、p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达的下调作用。这些结果表明miR-202-5p介导ROCK1对ARDS诱导的新生大鼠肺损伤的改善作用可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路激活有关。
综上所述，miR-202-5p通过靶向抑制ROCK1表达改善ARDS诱导的新生大鼠肺损伤，其机制可能与抑制ROCK1介导的TLR4/NF-κB信号通路激活有关。本研究为miR-202-5p作为治疗ARDS致新生儿肺损伤的有效药物靶点提供了理论依据。
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