2025, Vol. 54文章信息
- 黄立敬, 陈子聪, 杨春春, 井雨, 聂文佳
- HUANG Lijing, CHEN Zicong, YANG Chunchun, JING Yu, NIE Wenjia
- CXCR3抑制剂对小鼠类风湿关节炎的治疗作用及机制
- Therapeutic effect and mechanism of CXCR3 inhibitor in rheumatoid arthritis in mice
- 中国医科大学学报, 2025, 54(9): 796-801
- Journal of China Medical University, 2025, 54(9): 796-801
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文章历史
- 收稿日期：2024-06-07
- 网络出版时间：2025-09-16 10:44:12
引用本文 |
2. 河北医科大学第一医院 胃肠病诊疗中心, 石家庄 050030
2. Gastrointestinal Di-sease Diagnosis and Treatment Center, The First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050030, China
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、自身免疫性疾病，表现为关节炎症、肿胀、疼痛以及功能减退。RA的发病率逐年上升[1-2]，且有大量患者在接受标准治疗后仍不能获得理想的治疗效果[3-4]。在RA的病理机制中，辅助T细胞（helper T，Th）1/Th2在免疫反应的平衡中起核心作用[5]。Th1主要产生γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）等促炎性细胞因子，而Th2则产生白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）等抗炎性细胞因子[6]。RA患者常常出现Th1/Th2细胞失衡，尤其是Th1活化过度，导致炎症持续和加剧。CXCR3作为CXC趋化因子家族的一个重要受体，在多种炎症疾病中具有核心作用[7]。CXCR3与其配体的相互作用可进一步扰乱Th1/Th2细胞平衡[8]。尤其在RA背景下，CXCR3的活化可能进一步促进Th1的活化和炎症介质的释放。抑制CXCR可能对Th1/Th2细胞平衡产生积极影响，有助于改善RA的病程。因此，本研究探讨了CXCR3抑制剂SCH 546738调节Th1/Th2细胞比例的潜在效果，以期为RA治疗提供新的策略。
1 材料与方法 1.1 主要材料BALB/C小鼠30只购自河北医科大学实验动物学部。CXCR3抑制剂SCH 546738购自美国MCE公司；RNA提取试剂、cDNA逆转录试剂盒和SYBR Green试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；LymphoprepTM分离液购自加拿大STEMCELL公司；CD4磁珠购自德国Miltenyi Biotec公司；抗肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IFN-γ、IL-1β和GAPDH抗体购自英国abcam公司；抗CD4、T-bet、GATA3抗体和True-Nuclear破膜试剂购自美国BioLegend公司；IFN-γ和IL-4 ELISA试剂盒购自江苏雨桐生物科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2 方法 1.2.1 小鼠分组及RA模型建立[9]将30只BALB/C小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组10只。利用骨胶原诱导法通过2次免疫建立小鼠RA模型。首次免疫时，选用牛Ⅱ型胶原蛋白与弗氏完全佐剂1∶1混合物并乳化，在小鼠尾部距根部约2 cm处进行皮下注射（100 μL/只）。21 d后进行第2次免疫，选用弗氏不完全佐剂与牛Ⅱ型胶原蛋白1∶1混合物并乳化，在小鼠尾部距根部约2 cm处与首次不同的位置进行皮下注射（100 μL/只）。免疫后的小鼠关节部位可观察到水肿、变形。造模成功后，治疗组小鼠灌胃SCH 546738（1 mg·kg-1·d-1），对照组和模型组给予相同体积生理盐水，持续4周。诱导建模4周后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，采集其后肢爪关节组织，立即冻存于-80℃备用。本研究所有动物实验均经我院伦理委员会审核批准（审批号20230621211）。
1.2.2 关节炎指数（arthritis index，AI）评分每周记录小鼠AI评分，评估小鼠关节炎的严重程度。0分，无关节炎；1分，双足小趾关节有轻微肿胀或踝关节水肿；2分，1个足趾的所有关节或2个足趾关节与踝关节同时水肿；3分，所有足趾关节与脚掌或踝关节以下红肿；4分，所有足趾红肿并伴有关节畸形。1只小鼠四足总评分最高为16分。AI评分≥1时为造模成功。
1.2.3 小鼠外周血CD4+ T细胞分离和分组收集对照组小鼠的外周血，并与PBS进行等体积稀释。利用LymphoprepTM分离液进行梯度离心后，用PBS洗涤，使用细胞计数器对外周血单个核细胞数量进行评估。向淋巴细胞悬液（5×106个细胞）中加入小鼠CD4磁珠，并在室温下孵育15 min。通过MACS柱分离和纯化，获得CD4+ T细胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养CD4+ T细胞，并将其分为CD4+ T组和CD4+ T+SCH 546738组。CD4+ T+SCH 546738组加入SCH 546738（50 nmol）共孵育6 h，CD4+ T组加入等体积溶剂。
1.2.4 实时PCR检测小鼠关节组织TNF-α、IFN-γ和IL-1β mRNA表达水平收集各组小鼠后肢爪关节组织，冰上碾碎。提取总RNA，反转录合成cDNA，进行实时PCR。实时PCR反应体系：cDNA模板1 μg，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），2× SYBR Green 10 μL，用RNase free ddH2O补足至20 μL。实时PCR反应条件：95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，72 ℃ 1 min延伸。GAPDH作为内参照。引物序列如下：TNF-α，正向5’-CCTGTAGCCCACGTCGTAG-3’，反向5’-GGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3’；IFN-γ，正向5’-GCCACGGCACAGTCATTGA-3’，反向5’-TGCTGATGGCCTGATTGTCTT-3’；IL-1β，正向5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3’，反向5’-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3’；GAPDH，正向5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’，反向5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’。用2-ΔΔCt方法计算mRNA相对表达量。
1.2.5 Western blotting检测小鼠关节组织TNF-α、IFN-γ和IL-1β蛋白表达水平收集各组小鼠后肢爪关节组织，冰上碾碎。使用全蛋白提取试剂盒获取细胞总蛋白，BCA蛋白定量。蛋白上样（30 μg/孔），进行10%SDS-PAGE，蛋白分离，凝胶转膜。用5%牛血清白蛋白于室温下封闭1 h。加入TNF-α、IFN-γ、IL-1β、GAPDH一抗（均1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜。TBST冲洗后，加入二抗，室温下孵育1 h。通过凝胶成像仪扫描，利用ImageJ软件分析各蛋白条带灰度，确定目标蛋白与参照蛋白的相对表达水平。
1.2.6 流式细胞术检测Th1/Th2细胞比例收集各组小鼠外周血（取血细胞沉淀并裂解红细胞）和提取的CD4+ T细胞。用含1%胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，加入CD4抗体（1×106/3 μL），4 ℃孵育30 min。加入True-NuclearTM破膜试剂，室温下孵育30 min。随后加入T-bet和GATA3抗体（1×106细胞/3 μL），4 ℃孵育30 min。PBS溶液洗涤2次后，通过流式细胞仪进行分析。Th1细胞比例（%）=T-bet+细胞数/CD4+细胞数× 100；Th2细胞比例（%）=GATA3+细胞数/CD4+细胞数×100。
1.2.7 ELISA检测小鼠血清IFN-γ和IL-4水平收集各组小鼠外周血，4 000 g离心10 min，采集上清。按照ELISA试剂盒操作说明书，检测血清中IFN-γ和IL-4水平。
1.3 统计学分析采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。计量资料用 x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CXCR3对小鼠RA模型AI评分的影响AI评分结果显示，在造模第2、3、4周时，与对照组相比，模型组小鼠AI评分升高（P < 0.05）；在第2、3、4周时，与模型组相比，治疗组小鼠AI评分降低（P < 0.05），见表 1。
| Group | n | 1 week | 2 weeks | 3 weeks | 4 weeks |
| Control | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Model | 10 | 0 | 2.4±0.41） | 4.2±0.41） | 6.8±0.61） |
| Treatment | 10 | 0 | 1.4±0.22） | 2.8±0.62） | 3.6±0.42） |
| F | - | 218.00 | 263.80 | 667.70 | |
| P | - | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group. | |||||
2.2 CXCR3抑制剂减轻小鼠RA模型关节组织炎症反应
实时PCR和Western blotting结果显示，与对照组相比，模型组小鼠关节组织TNF-α、IFN-γ和IL-1β mRNA和蛋白表达升高（P < 0.05）；与模型组相比，治疗组小鼠关节组织TNF-α、IFN-γ和IL-1β mRNA和蛋白表达降低（P < 0.05），见表 2、表 3、图 1。
| Group | n | TNF-α | IFN-γ | IL-1β |
| Control | 10 | 1.00±0.11 | 1.00±0.12 | 1.00±0.13 |
| Model | 10 | 5.78±0.341） | 3.67±0.281） | 4.62±0.311） |
| Treatment | 10 | 3.23±0.242） | 2.12±0.172） | 3.35±0.262） |
| F | 926.20 | 443.10 | 560.30 | |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group. | ||||
| Group | n | TNF-α | IFN-γ | IL-1β |
| Control | 10 | 1.00±0.11 | 1.00±0.12 | 1.00±0.13 |
| Model | 10 | 2.26±0.221） | 2.63±0.241） | 2.42±0.181） |
| Treatment | 10 | 1.87±0.162） | 1.56±0.152） | 1.72±0.162） |
| F | 145.00 | 217.70 | 201.90 | |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group. | ||||
|
| 图 1 3组小鼠关节组织TNF-α、IFN-γ和IL-1β蛋白表达 Fig.1 TNF-α, IFN-γ, and IL-1β protein expression levels in the joints tissues of the three groups of mice |
2.3 CXCR3抑制剂改善小鼠RA模型体内Th1/Th2细胞比例
流式细胞术结果显示，与对照组相比，模型组小鼠外周血Th1细胞增加（P < 0.05），Th1/Th2细胞比例升高（P < 0.05）；与模型组相比，治疗组小鼠外周血Th1细胞（P < 0.05）减少，Th1/Th2细胞比例降低（P < 0.05）。ELISA结果显示，与对照组相比，模型组小鼠血清中IFN-γ水平升高（P < 0.05）；与模型组相比，治疗组小鼠血清中IFN-γ水平降低（P < 0.05）。见表 4。
| Group | n | Percentage of Th1（%） | Percentage of Th2（%） | Th1/Th2 cell ratio | IFN-γ（pg/mL） | IL-4（pg/mL） |
| Control | 10 | 0.18±0.02 | 0.21±0.01 | 0.86±0.02 | 13.34±0.15 | 5.74±0.08 |
| Model | 10 | 0.71±0.041） | 0.42±0.031） | 1.71±0.111） | 21.62±0.221） | 32.71±0.261） |
| Treatment | 10 | 0.43±0.022） | 0.28±0.022） | 1.54±0.082） | 16.24±0.142） | 16.78±0.172） |
| F | 878.80 | 245.00 | 321.10 | 5 852.00 | 53 597.00 | |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group. | ||||||
2.4 CXCR3抑制剂调控CD4+ T细胞Th1/Th2极化和迁移能力
流式细胞术结果显示，与CD4+ T组相比，CD4+ T+ SCH 546738组Th1细胞减少，Th1/Th2细胞比例降低（P < 0.001），见表 5。
| Group | n | Percentage of Th1（%） | Percentage of Th2（%） | Th1/Th2 cell ratio |
| CD4+ T | 10 | 1.52±0.27 | 2.35±0.23 | 0.66±0.02 |
| CD4+ T+SCH 546738 | 10 | 0.78±0.15 | 2.28±0.18 | 0.34±0.01 |
| t | 7.58 | 0.76 | 45.25 | |
| P | < 0.001 | 0.46 | < 0.001 |
3 讨论
RA可侵犯多个关节，并可能导致结构性伤害和功能丧失。尽管其确切的病因和病理机制尚不完全清楚，但免疫介导的反应在RA的发病过程中起关键作用[10]。RA的病理特征是滑膜内膜增生和包括单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞在内的炎症细胞浸润[11]。在免疫调节机制中，Th1/Th2细胞平衡被认为对RA的发生发展具有重要意义[12]。本研究中，RA模型组小鼠AI随时间推移逐渐升高，滑膜组织中TNF-α、IFN-γ和IL-1β等炎性细胞因子表达增加，表明骨胶原诱导法建立小鼠RA模型成功。与对照组相比，模型组小鼠的外周血Th1细胞数量明显增加，血清中IFN-γ水平升高，而Th2细胞数量和IL-4水平无显著变化，最终导致Th1/Th2细胞比例升高，进一步证实了Th1/Th2细胞失衡在RA病理进程中的重要作用。
CXCR作为一种CXC趋化因子受体，主要在活化的T细胞上表达，对调节T细胞，特别是Th1细胞的迁移和活化起着至关重要的作用[13]。在RA的发病机制中，CXCR3的作用尤为关键。RA病理特征之一是滑膜组织的慢性炎症反应，CXCR3在RA中表达增加，在关节的滑膜组织中尤为显著。这种表达增加与炎症细胞，特别是Th1细胞的浸润和活化密切相关，加剧了关节的炎症和破坏[14]。CXCR3通过其配体，如IFN-γ诱导蛋白10（inducible protein 10，IP-10）和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1），有效地促进Th1型免疫反应[15]。研究[16]表明，过表达miR-34a-5p诱导M1巨噬细胞分泌大量IP-10，后者可以通过T细胞表面CXCR3受体激活CD4+ T细胞向促炎症型T细胞（Th1）极化，从而发挥肿瘤抑制作用。NGWENYAMA等[17]发现，异常分泌的IP-10可通过CXCR3募集大量Th1细胞至心脏，引起心力衰竭。这些配体的表达在RA患者的滑膜组织和关节液中显著上调，进一步加剧了Th1细胞介导的炎症反应。因此，CXCR3及其配体之间的相互作用在RA的病理进程中发挥了关键作用，对Th1/Th2细胞平衡产生重要影响。本研究中，用CXCR3抑制剂SCH 546738干预后，小鼠RA状态得到改善，表现为AI降低，滑膜组织中TNF-α、IFN-γ和IL-1β等炎性细胞因子表达水平下降。与模型组相比，治疗组小鼠外周血中Th1细胞数量明显减少，血清中IFN-γ水平降低。同时，Th2细胞数量和IL-4水平无显著改变，治疗组Th1/Th2细胞比例回调。此外，流式细胞术结果证明，CXCR3抑制剂SCH 546738直接抑制了CD4+ T细胞向Th1极化，并且抑制了T细胞的迁移。
本研究存在一定的局限性，如主要聚焦于小鼠模型，而小鼠模型与人类RA的病理存在差异，因此，本研究结果的临床适用性需要进一步的验证。此外，本研究主要集中于Th1和Th2细胞的平衡，未涉及其他潜在的CD4+ T免疫细胞类型，如Th17和Treg，可能限制了对RA全貌的理解。
综上所述，本研究揭示了CXCR3在调节小鼠RA模型炎症反应中的重要作用，尤其是在控制Th1/Th2细胞平衡方面。CXCR3抑制剂SCH 546738对小鼠RA模型具有显著疗效，提示CXCR3抑制剂可能是治疗RA的有效策略。以上发现不仅为理解RA的免疫调节机制提供了新的视角，也为开发针对RA的新治疗策略提供了重要的科学依据。
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