2025, Vol. 54文章信息
- 加力哈斯·托来西, 李岩, 罗彬, 古再努尔·艾尼瓦尔, 贾文婷, 王博青
- TUOLAIXI Jialihasi, LI Yan, LUO Bin, AINIWAER Guzainuer, JIA Wenting, WANG Boqing
- 吴茱萸碱通过抑制NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路减轻脓毒症大鼠肝损伤
- Evodiamine alleviates liver injury in septic rats by influencing the NLRP3/IL-1β/caspase-1 signaling pathway
- 中国医科大学学报, 2025, 54(8): 702-708
- Journal of China Medical University, 2025, 54(8): 702-708
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文章历史
- 收稿日期：2025-02-21
- 网络出版时间：2025-07-29 11:19:19
引用本文 |
脓毒症是一种由全身感染引起的临床危重症，伴随严重炎症反应和免疫失调，可能导致器官功能衰竭[1]。由其引发的肝衰竭或肝功能障碍是脓毒症并发症之一，也是脓毒症的死亡原因之一[2-3]。目前，针对脓毒症引起的肝损伤，临床上主要以抗氧化、抗感染、抗炎等药物干预为主，但整体治疗效果不理想[4]。因此，需要深入研究发病机制，寻找理想靶点与相关药物以有效缓解脓毒症所致肝损伤，改善患者的治疗结局。
NLRP3炎症复合体是一种多蛋白复合物，主要由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和胱天蛋白酶1（caspase-1）组成，存在于细胞质中，是免疫系统的重要部分。NLRP3激活后可诱导caspase-1激活及促炎性细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-1β分泌，引起细胞损伤[5-7]。研究[8-10]表明，NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路参与肝纤维化，推测可能是改善脓毒症肝损伤治疗结局的潜在靶点。吴茱萸碱（evodiamine，EVO）是一种从传统药物吴茱萸中提取的生物碱，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤和保护肝脏等药理活性[11-12]。目前，尚不清楚EVO是否能通过调控NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路对脓毒症肝损伤起保护作用。因此，本研究通过构建脓毒症大鼠肝损伤模型，给予不同剂量EVO，探讨其对脓毒症模型大鼠肝损伤的作用及可能的机制，以期为EVO的临床应用提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠（6~8周龄），购自江苏青龙山生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（苏）2024-0001。将大鼠适应性饲养（自由进食、饮水，光照、温度、湿度适宜）1周后开始实验。本研究所有动物实验均获得我院伦理委员会批准（审批号IACUC-20240514-140）。
1.1.2 主要试剂与仪器EVO（货号SC11654，北京凯诗源生物科技有限公司）；NLRP3信号通路激活剂尼日利亚菌素钠盐（货号HY-100381，美国MedChemexpress公司）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-6、IL-1β检测ELISA试剂盒（货号JL10208-96T、JL14113-96T、JL13662-96T，上海江莱生物科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（货号P0011，上海碧云天生物技术股份有限公司）；NLRP3、IL-1β、caspase-1、GAPDH一抗（货号15101、12703、24232、2118，美国Cell Signaling Technology公司）；山羊抗兔IgG H（4）L（HRP）（货号ab205718，英国abcam公司）；酶标仪（型号1410101，美国Thermo Fisher Scientific公司）；倒置显微镜（型号IXplore IX85，日本Olympus公司）。
1.2 方法 1.2.1 大鼠分组及处理大鼠适应性饲养1周后，采用盲肠结扎穿刺[13]构建脓毒症模型。麻醉大鼠（1%戊巴比妥钠40 mg/kg）后开腹，拉出盲肠并在回盲瓣处结扎（防止肠梗阻），刺破盲肠，轻轻挤压排便后，将盲肠放回并缝合伤口。假手术组不结扎与穿刺，其余步骤相同。24 h后从大鼠尾静脉取血，检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminas，AST）水平均高于对照组，提示脓毒症肝损伤模型构建成功。
将建模成功的大鼠分为模型组及L-EVO组、M-EVO组、H-EVO组（EVO灌胃4、8、16 mg/kg [14]）和H-EVO+NLRP3组（EVO灌胃16 mg/kg+尼日利亚菌素钠盐腹腔注射1 mg/kg[14]），每组各10只，假手术组与模型组灌胃等量生理盐水，1次/d，连续28 d。
1.2.2 样品采集末次给药结束时，经大鼠尾静脉取血，离心分离血清，冻存于-80 ℃。麻醉并处死大鼠，小心分离大鼠肝组织，并按不同实验目的对肝组织做初步处理，即将大鼠肝组织置于4%多聚甲醛中固定（用于病理检测），或冻存于-80 ℃（用于蛋白检测）。
1.2.3 大鼠肝功能检测取冻存大鼠血清，快速解冻，严格按照AST检测试剂盒（货号SBJ-R0117，南京森贝伽生物科技有限公司）、ALT检测试剂盒（货号YS084998，上海雅吉生物科技有限公司）说明书检测大鼠血清中AST、ALT水平。
1.2.4 HE染色检测大鼠肝组织病理变化取多聚甲醛中固定（4 ℃，24 h）结束的大鼠部分肝组织，进行梯度乙醇脱水、包埋、切片、水化等处理，HE染色，磷酸盐缓冲液清洗切片，脱水封片后，光镜下观察大鼠肝组织病理变化。
1.2.5 TUNEL染色检测大鼠肝组织细胞凋亡取大鼠肝脏部分组织，石蜡包埋、切片、脱蜡后，使用蛋白酶K稀释液孵育，按TUNEL凋亡试剂盒说明书进一步处理，封片后于显微镜下观察（波长488 nm）肝组织细胞凋亡情况。
1.2.6 ELISA检测大鼠血清炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达取血清快速解冻后，按ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平。
1.2.7 Western blotting检测大鼠肝组织中NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路蛋白表达取适量大鼠肝组织，匀浆后使用RIPA裂解液混合物提取蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，变性蛋白并上样后，进行电泳、转膜、封闭。加入NLRP3（1∶1 000稀释）、IL-1β（1∶1 000稀释）、caspase-1（1∶1 000稀释）、GAPDH（1∶1 000稀释）一抗4 ℃过夜孵育，PBST洗涤，加入对应二抗（1∶2 000稀释）室温孵育2 h，PBST洗膜后，显色曝光，用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，对大鼠肝组织中的NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路相关蛋白进行定量分析。
1.3 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示，采用单因素方差分析进行多组比较，采用事后SNK-q检验进行两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 EVO对脓毒症大鼠肝功能的影响与假手术组相比，模型组大鼠ALT、AST升高；与模型组相比，L-EVO组、M-EVO组、H-EVO组大鼠ALT、AST降低，且具有剂量依赖性；与H-EVO组相比，H-EVO+NLRP3组大鼠ALT、AST升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表 1。
| Group | AST | ALT |
| Sham | 76.32±9.24 | 34.27±5.62 |
| Model | 158.25±17.621） | 79.65±9.211） |
| L-EVO | 132.36±15.542） | 57.82±7.632） |
| M-EVO | 105.12±12.272），3） | 45.33±6.242），3） |
| H-EVO | 81.45±9.642），3），4） | 38.59±5.232），3），4） |
| H-EVO+NLRP3 | 147.56±16.425） | 65.42±8.255） |
| 1）P < 0.05 vs. sham group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. L-EVO group；4）P < 0.05 vs. M-EVO group；5）P < 0.05 vs. H-EVO group. n = 10. | ||
2.2 EVO对脓毒症大鼠肝组织病理改变的影响
与假手术组相比，模型组大鼠肝组织失去正常结构，肝细胞分布不均匀，伴有水肿与空泡，核固缩；与模型组相比，L-EVO组、M-EVO组、H-EVO组大鼠肝组织细胞形态逐渐恢复，细胞排列相对整齐，水肿与空泡减轻，且随着剂量增加逐渐明显；与H-EVO组相比，H-EVO+NLRP3组大鼠肝组织损伤加重。见图 1。
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| A, sham group; B, model group; C, L-EVO group; D, M-EVO group; E, H-EVO group; F, H-EVO+NLRP3 group. 图 1 大鼠肝组织病理变化情况 HE ×200 Fig.1 Pathological changes in rat liver tissue HE ×200 |
2.3 EVO对脓毒症大鼠肝组织细胞凋亡的影响
与假手术组（6.23%±2.05%）相比，模型组大鼠肝组织细胞凋亡率（34.57%±6.21%）升高；与模型组相比，L-EVO组（26.35%±5.42%）、M-EVO组（18.64%±4.23%）、H-EVO组（11.82%±2.46%）大鼠肝组织细胞凋亡率降低；与H-EVO组相比，H-EVO+NLRP3组大鼠肝组织细胞凋亡率（32.94%±5.22%）升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见图 2。
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| 图 2 大鼠肝组织细胞凋亡情况 TUNEL ×200 Fig.2 Apoptosis in rat liver cells TUNEL ×200 |
2.4 EVO对脓毒症大鼠炎性细胞因子水平的影响
与假手术组相比，模型组大鼠IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高；与模型组相比，L-EVO组、M-EVO组、H-EVO组大鼠IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低，且呈剂量依赖性；与H-EVO组相比，H-EVO+NLRP3组大鼠IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高（均P < 0.05）。见表 2。
| Group | IL-6 | TNF-α | IL-1β |
| Sham | 25.12±6.03 | 21.06±4.25 | 14.67±3.42 |
| Model | 63.45±8.621） | 45.83±6.341） | 37.59±5.211） |
| L-EVO | 51.67±6.342） | 36.43±5.262） | 31.58±4.622） |
| M-EVO | 45.58±5.292），3） | 29.72±4.322），3） | 25.36±5.172），3） |
| H-EVO | 31.24±4.523），4） | 23.35±4.282），3），4） | 17.32±3.452），3），4） |
| H-EVO+NLRP3 | 58.63±7.215） | 41.54±5.075） | 36.27±5.045） |
| 1）P < 0.05 vs. sham group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. L-EVO group；4）P < 0.05 vs. M-EVO group；5）P < 0.05 vs. H-EVO group. | |||
2.5 EVO对脓毒症大鼠肝组织中NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路蛋白表达的影响
与假手术组相比，模型组大鼠NLRP3、IL-1β、caspase-1蛋白表达上调；与模型组相比，L-EVO组、M-EVO组、H-EVO组大鼠NLRP3、IL-1β、caspase-1蛋白表达下调；与H-EVO组相比，H-EVO+NLRP3组大鼠NLRP3、IL-1β、caspase-1蛋白表达上调，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见图 3、表 3。
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| 图 3 Western blotting检测NLRP3、IL-1β、caspase-1蛋白表达情况 Fig.3 Western blotting analysis of NLRP3, IL-1β, and caspase-1 protein expressions |
| Group | NLRP3 | IL-1β | Caspase-1 |
| Sham | 0.36±0.08 | 0.25±0.06 | 0.23±0.04 |
| Model | 1.87±0.421） | 1.69±0.311） | 1.86±0.371） |
| L-EVO | 1.26±0.342） | 1.35±0.322） | 1.42±0.452） |
| M-EVO | 0.69±0.252），3） | 0.75±0.232），3） | 0.71±0.212），3） |
| H-EVO | 0.47±0.132），3），4） | 0.36±0.122），3），4） | 0.38±0.092），3），4） |
| H-EVO+NLRP3 | 1.63±0.395） | 1.64±0.295） | 1.79±0.325） |
| 1）P < 0.05 vs. sham group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. L-EVO group；4）P < 0.05 vs. M-EVO group；5）P < 0.05 vs. H-EVO group. | |||
3 讨论
脓毒症是宿主对感染的异常反应所致危及生命的器官功能障碍综合征，发病率及病死率均较高[15]。由脓毒症引发的肝损伤可存在于病程中任何时期，也是进展为多器官功能障碍的指征。早期肝功能损伤可提示脓毒症患者预后不良[16]。因此，改善肝功能对提高脓毒症患者预后具有重大意义。目前，对脓毒症临床上常使用液体复苏、抗氧化、抗炎、清除毒素等综合治疗，但整体疗效有待进一步提高。持续探索新的治疗靶点对提高该类危重患者的治疗效果，改善治疗结局至关重要。本研究采用盲肠结扎穿刺建立脓毒症肝损伤大鼠模型，通过检测大鼠肝功能相关指标、HE染色、TUNEL染色发现，与假手术组相比，模型组大鼠肝组织失去正常结构，肝细胞出现水肿与空泡，ALT、AST水平升高，肝组织细胞凋亡率明显升高，血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β高表达，表现出明显的肝组织病理性损伤，提示炎性细胞浸润促进了肝组织损伤。
研究[17]表明，当核心蛋白NLRP3被上游信号激活后，可通过与衔接蛋白ASC以及无活性的caspase-1结合，形成NLRP3炎症复合体，活化caspase-1，切割IL前体，使其成熟并释放，介导炎症反应。在脓毒症疾病进展过程中，肝损伤主要与感染引发的代谢失衡、炎症有关，NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路可促进疾病进展，有望成为脓毒症肝损伤的有效治疗靶点[18-19]。谢航等[20]发现，ASP可通过活化AMPK阻碍NLRP3炎症复合体的激活，进而抑制细胞焦亡，减轻脓毒症大鼠肠道损伤。LIU等[21]发现，抗坏血酸6-棕榈酸酯可通过抑制脓毒症肝脏中NF-κB和NLRP3炎症复合体信号通路活化，减少巨噬细胞活化和炎性细胞因子产生，从而保护肝脏免受脓毒症侵袭。ABOYOUSSEF等[22]发现，格拉司琼可通过降低TNF-α、IL-6、HMGB1和NF-κB、NLRP3水平，减轻盲肠结扎穿刺脓毒症大鼠模型肝损伤和炎症反应。本研究发现，与假手术组相比，模型组大鼠肝组织中，NLRP3、IL-1β、caspase-1蛋白表达显著上调，提示NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路激活可能是导致脓毒症大鼠肝组织损伤的重要原因。
吴茱萸是传统中药，最早记载于《神农本草经》，含有多种化学成分，如生物碱、挥发油、黄酮类等，其中EVO作为生物碱的代表性化合物，具有抗炎、保肝、抗凋亡、抗菌、降糖等多种活性[23]。陈祺松等[24]证实，EVO预处理可通过调控JNK/Mff通路改变线粒体膜电位，介导线粒体凋亡途径，抑制细胞凋亡，从而减轻肝细胞损伤。LI等[25]证实，EVO通过抑制内质网应激介导的胱天蛋白酶12（caspase-12）和NF-κB通路，改善脓毒症诱导的腹腔巨噬细胞凋亡和炎症反应。本研究结果发现，给予模型组大鼠不同剂量EVO可剂量依赖性下调NLRP3、IL-1β、caspase-1蛋白表达，抑制NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路激活，减轻大鼠肝组织损伤（肝组织细胞形态逐渐恢复，细胞排列相对整齐，肝组织细胞凋亡率降低，IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平降低），并改善大鼠肝功能（ALT、AST水平降低）。而联合NLRP3信号通路激活剂尼日利亚菌素钠盐时，可部分逆转EVO对大鼠肝组织的保护作用，提示EVO可能通过抑制NLRP3组装或活化过程，抑制NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路激活，从而减少其下游炎症反应，保护大鼠肝组织。
综上所述，EVO可有效减轻脓毒症大鼠肝组织损伤，其机制可能是通过抑制NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路实现。本研究结果揭示了EVO治疗脓毒症肝损伤的优势，为EVO的进一步研究与应用提供了科学依据。然而，脓毒症涉及的影响因素及病理机制较复杂，EVO是否通过其他机制调控NLRP3/IL-1β/caspase-1信号通路，有待进一步研究。
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